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目的:1、通过建立大鼠代谢性内毒素血症及肝胰岛素抵抗模型,探讨代谢性内毒素血症对肝线粒体结构与能量代谢的影响;2、通过体外实验,探讨内毒素(LPS)对大鼠正常肝细胞线粒体结构及能量代谢的直接影响。方法:在体实验:30只雄性SD大鼠随机分三组(每组10只):正常对照组(NC组)、高果糖组(HFD组,10%果糖水喂养)、LPS组(皮下注射LPS 300μg·kg-1·d-1)。每周检测并记录大鼠体重,8周末,禁食12 h以上,腹腔注射糖耐量实验结束后,经乙醚麻醉腹主动脉采血,4℃3500 r/min离心10 min,取血浆分装后置于-40℃保存。分离肝脏组织,部分置于4%多聚甲醛溶液中固定12~24 h,冲洗修整,经常规石蜡包埋切片,行苏木素伊红染色(H&E染色);剩余样本置液氮速冻后转-80℃保存。1、腹腔注射糖耐量实验(IPGTT)每周检测大鼠体重变化,8周末,空腹腹腔注射50%葡萄糖溶液(2 g/kg)。尾静脉采血,采用快速血糖仪(罗氏活力型)分别检测注射前(0 min)与注射后(15min、30 min、120 min)血糖水平。2、血浆肝酶、LPS检测及肝胰岛素抵抗评估采用酶法测定血糖、血浆AST及ALT;鲎试剂法检测血浆LPS水平;ELISA法检测胰岛素变化,计算胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR),公式为:HOMA-IR=空腹血糖(FPG,mmol/L)×空腹胰岛素(FINS,EU/ml)/22.5。3、氧化损伤产物及能量代谢指标检测采用酶法检测并计算血浆中GSH-PX的水平;ELISA法检测血浆中氧化损伤产物(8-Ohd G、MDA、4-HNE)及能量代谢指标(ADP、ATP)的表达。4、肝脏组织病理学检测于4%多聚甲醛固定液中取出肝脏组织,冲洗修整后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋切片,厚度5μm,行H&E染色,光镜下观察肝组织病理学变化。5、Western blot分析采用Western blot检测肝组织胰岛素信号转导关键蛋白(p-IRS1Tyr632、IRS1、p-PI3KTyr458、PI3K)及线粒体内膜受体蛋白(UCP2)表达。离体实验:采用改良胶原酶二步灌流法,体外分离培养大鼠肝细胞并随机分为四组:正常对照组(NC组,DMEM培养液培养)、高果糖组(HFD组,培养液+4.5 g/L果糖水)、LPS组(培养液+10 mg/L LPS)、果糖并LPS干预组(H+L组,培养液+4.5g/L果糖水+10 mg/L LPS)。20 h后,吸取并分装细胞上清液,胰酶(含EDTA)消化,2000 r/min离心3 min后弃上清,收取肝细胞于-40℃冷冻保存。1、氧化损伤产物及能量代谢指标检测采用ELISA法检测细胞上清液中氧化损伤产物(8-Ohd G、MDA、4-HNE)及能量代谢指标(ADP、ATP)的表达。2、Western blot分析采用Western blot检测肝细胞中胰岛素信号转导关键蛋白(p-IRS1Tyr632、IRS1、p-PI3KTyr458、PI3K)、线粒体内膜受体蛋白(UCP2)表达。结果:在体实验:1、体重变化及糖耐量结果实验期间,各组大鼠总体状态良好。与NC组相比,HFD组与LPS组大鼠体重在2~8周显著增高(P<0.01,P<0.05)。HFD组与LPS组各时间点血糖均显著高于NC组(P<0.01,P<0.05),表明HFD组与LPS组大鼠发生糖耐量异常。2、血浆肝酶、LPS检测及肝胰岛素抵抗评估结果HFD组与LPS组的肝酶、FINS、FPG、LPS水平及HOMA-IR显著高于NC组(P<0.01),HFD组与LPS组无统计学差异(P>0.05)。3、氧化损伤产物及能量代谢指标变化HFD组与LPS组8-OhdG、MDA、4-HNE及GSH-PX显著高于NC组(P<0.01),HFD组与LPS组差异无统计学意义。能量代谢指标,HFD组与LPS组ADP、ATP与NC组相比显著降低(P<0.01),HFD组与LPS组差异无统计学意义(P>0.05)。4、肝组织病理学变化NC组肝脏呈暗红色,无油腻感,H&E染色后光镜下可见肝索呈放射状排列。HFD组与LPS组肝脏有明显油腻感;镜下可见肝细胞包浆内出现脂滴空泡并伴有气球样变。5、Western blot结果与NC组相比,HFD组与LPS组肝组织IRS1、PI3K表达、p-IRS1Tyr632/IRS1和p-PI3KTyr458/PI3K比值则显著降低(P<0.01),UCP2表达显著升高(P<0.01),HFD组与LPS组相比无统计学意义(P>0.05)。离体实验:1、氧化损伤产物及能量代谢指标变化HFD组、LPS组及H+L组8-Ohd G、MDA及4-HNE显著高于NC组(P<0.01,P<0.05),能量代谢指标与NC组比较,HFD组、LPS组及H+L组ADP、ATP显著降低(P<0.05)。HFD组、LPS组及HFD+LPS组差异无统计学意义(P>0.05)。2、Western blot结果与NC组相比,HFD组、LPS组及H+L组肝细胞IRS1、PI3K表达、p-IRS1Tyr632/IRS1和p-PI3KTyr458/PI3K比值则显著降低(P<0.01,P<0.05),UCP2表达显著升高(P<0.01),HFD组、LPS组及H+L组相比无统计学意义(P>0.05)。结论:1、高果糖饮食及皮下注射LPS可诱发大鼠胰岛素抵抗和代谢性内毒素血症,并伴有氧化应激和肝细胞线粒体功能障碍。2、LPS可诱导氧化中间产物生成增多,清除减少,致使肝脏处于氧化应激状态,进而破坏肝细胞线粒体结构,影响其能量代谢,加速胰岛素抵抗及代谢性疾病的发生发展。