文献研究:随着经济的发展、环境的改变、人们工作节奏的加快、生活方式的改变以及人口老龄化的加速,糖尿病(diabetes mellitus,DM)已成为影响人类健康最重要的慢性非传染性疾病。在众多DM并发症中,DM大血管病变,包括冠状动脉、脑动脉、下肢动脉病变,是DM最主要的致死致残并发症。研究指出,DM患者患上大血管病变的风险比非DM患者增加2-4倍,75%的DM患者最终死于DM大血管病变诱发的心脑血管事件。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是DM大血管病变的主要病理表现,早期发现AS,并使用相应药物进行干预,对延缓AS进展、改善患者预后、降低心脑血管终点事件十分重要。然而,目前西医学对于早期筛查AS尚缺乏敏感性和特异性高的检验学指标,在药物治疗方面亦存在消化道出血、横纹肌溶解等副作用,因此亟需寻找一种更安全、更高效的药物以用于临床。目前认为晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products,AGEs)的过多生成,AGEs-RAGE途径的激活是DM大血管病变的重要发病机制,许多实验与临床研究证实AGEs水平与DM大血管病变具有显著相关性,但目前仍缺乏相应的循证证据支持。中医学虽无DM大血管病变之统称,但可散见于"胸痹"、"真心痛"、"眩晕"、"晕厥"、"中风"、"痴呆"、"偏枯"、"痹症"、"脱疽"、"痰饮"、"瘀血""厥证"等病名,古今医家数千年以来对治疗此类疾病积累了丰富的经验。熊曼琪教授是广州中医药大学首席教授,基于消渴病"气阴两虚,瘀热互结"的病机,熊教授在《伤寒论》桃核承气汤基础上开发出加味桃核承气汤以用于临床,并取得良好疗效。前期研究已发现,加味桃核承气汤具有降糖、调脂、改善胰岛素抵抗、保护胰岛β细胞,改善众多DM并发症的作用。朱章志教授认为,DM大血管病变临床表现复杂多变,其背后的病机随着疾病的进展而变化,大多数患者病机还具有"少阴阳虚"、"阳失健运"的特点,并据此对熊教授原创加味桃核承气汤作出了相应的配伍加减。为进一步研究各组方对防治DM大血管病变的可能机制,优化加味桃核承气汤的组方配伍,本研究以AGEs-RAGE途径、氧化应激为研究切入点,借助动物实验,运用多种现代科学手段加以评估,以期进一步发掘加味桃核承气汤的临床效能。循证研究:目的:AGEs的生成过多,AGEs-RAGE途径的激活是DM大血管病变的重要发病机制,已有多个研究发现DM大血管病变患者的血清AGEs水平与单纯DM患者(指未发现DM并发症的患者)、健康人群相比存在显著差异,但至今尚未有循证医学上的证据。因此,本研究拟采用Meta分析的方法,根据初定的纳入排除标准,检索国内外相关文献,并对纳入文献的数据进行合并分析,以探讨AGEs与DM大血管病变的相关性,从而为AGEs未来的临床应用提供一定的循证支持。方法:根据初定的纳入排除标准,以"晚期糖基化终末产物"、"糖尿病大血管病变"、"冠心病""、"脑卒中"、"糖尿病足"、"下肢动脉病变"、"动脉粥样硬化"、"AGEs"、、"coronary heart disease"、"diabetic macroangiopathy"、"atherosclerosis"、"diabetic foot"、"cerebral apoplexy"检索国内外数据库关于AGEs与DM大血管病变、单纯DM患者以及健康人群的文献,筛选出要纳入的文献后,从中提取文献的一般特征及相关纳入指标,并使用RevMan 5.3统计软件对纳入指标进行Meta分析。最后根据Meta分析的结果对AGEs与DM大血管病变的相关性进行分析推理,对其中存在异质性的部分使用敏感性分析等手段处理,并借助漏斗图对文献进行发表偏倚评估。结果:共纳入14个研究,1290例患者,其中DM大血管病变患者338例,单纯DM患者607例,健康人群345例,Meta分析结果表明,AGEs-CML方面,DM大血管病变患者较单纯DM患者、健康人群显著升高(P<0.01),且经过敏感性分析后结果稳定;AGEs方面,DM大血管病变患者较健康人群显著升高(P<0.01),DM大血管病变患者经敏感性分析后较单纯DM患者显著升高(P<0.01)。结论:以AGEs-CML为代表,DM大血管病变患者血清AGEs-CML水平较单纯DM患者、健康人的存在显著差异,其机制可能为DM大血管病变患者AGEs生成过多,激活AGE-RAGE途径,引起下游一系列通路的氧化应激、炎症反应,从而破坏血管内皮细胞,影响血管内皮功能,促进AS的进展,最终发展为DM大血管病变。本次Meta分析从循证医学角度印证了 AGEs在DM大血管病变中具有一定的特异性升高,但受研究质量、异质性的影响,AGEs要成为一种特异性、敏感性指标用于DM大血管病变诊断、评估仍有待进一步大样本、高质量、多中心的临床研究、实验研究加以证实。实验研究:目的:立足朱章志教授对DM大血管病变的诊疗经验,对熊曼琪教授原创加味桃核承气汤进行配伍加减,进一步加减变化为中药2组(原创方改生大黄为熟大黄,倍芒硝)、中药3组(原创方入细辛,倍桂枝)。基于AGEs-RAGE途径及其下游的氧化应激通路,通过与中药1组(原创方)、西药组(氨基胍)作对比,借助动物实验、HE染色、QRT-PCR、IHC、电子显微镜、Western blotting、ELISA等现代医学手段,以探讨加味桃核承气汤防治T2DM大血管病变的可能作用机制,以期发掘加味桃核承气汤防治T2DM大血管病变的更优配伍组方及作用潜能,从而为临床应用提供一定的实验证据。方法:120只雄性SD大鼠经普通饲料适应性喂养1周后,按随机数字表法随机抽出10只大鼠作为正常组,该组继续使用普通饲料喂养,余下110只大鼠作为造模组改用高糖高脂饲料喂养6周。6周后进行预实验,预实验后确定STZ40mg/kg为造模剂量,隔日对剩余89只大鼠按40 mg/kg的剂量腹腔注射STZ造模,正常组则腹腔注射等量柠檬酸缓冲液,两次FPG稳定在11.1mmmol/L以上确立为T2DM成模大鼠,最后共成模74只。将成模大鼠按FPG水平分层,然后按分层情况进一步随机分为5组,其中模型组14只,中药1组15只、中药2组15只、中药3组15只,西药组15只。实施药物干预共8周。实验期间观察大鼠的一般情况,每隔4周测大鼠体重、摄食量、摄水量及尾尖FPG,实验结束时使用ELISA法检测FINS,计算Homa-IR;全自动生化分析仪检测HbAlc、TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD、CAT、GSH-Px等血糖血脂、氧化应激指标;ELISA法测胸主动脉AGEs的含量,光镜、电镜观察胸主动脉病理形态,IHC法观察胸主动脉AGEs的染色情况,Western blotting法检测各组大鼠胸主动脉ERK1/2蛋白的表达、RTQ-PCR法检测各组大鼠胸主动脉RAGEmRNA、eNOSmRNA、p47phoxmRNA的表达。结果:1、一般情况:正常组在实验全过程保持精神状况良好,皮肤嫩滑,毛色光亮,体重平稳上升,尿量、粪便量正常,无多饮、多食。模型组大鼠则出现明显多饮、多食、多尿、消瘦等症状,精神差,反应缓慢,毛发干枯,皮肤干燥,粪便量偏少偏硬。药物干预后,各药物干预组大鼠的精神情况、体征、体重、口干多饮等症状较模型组都得到不同程度的改善,但仍较正常组差。最终大鼠共死亡11只,其中模型组死亡4只,中药1组死亡3只,中药2组死亡2只,中药3组死亡1只,西药组死亡1只。死亡原因主要考虑糖尿病酮症酸中毒、糖尿病高渗性昏迷、灌胃失误导致肺部感染等急性并发症。实验结束共71只大鼠完成实验,其中正常组10只,模型组10只,中药1组11只,中药2组12只,中药3组14只,西药组14只。体重、摄水量、摄食量方面,正常组体重随着时间迁移平稳增加,摄水量、摄食量则无明显变化;模型组体重则逐渐下降,摄水量、摄食量逐步增加;分析时间因素、干预因素、时间因素与干预因素的交互作用,各药物干预组差异均具有统计学意义(P<0.01);药物干预8周后,各药物干预组在增加体重、降低摄水量、降低摄食量方面均显著优于模型组(P<0.01),但较正常组仍较差(P<0.01),其中中药3组在增加体重、降低摄水量方面显著优于其余药物干预组(P<0.01),在摄食量改善方面与其他药物干预组相当(P>0.05),中药1组、中药2组在减少摄水量方面显著优于西药组(P<0.01)。2、糖脂代谢及胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),药物干预8周后,各药物干预组在FPG、HbAlc方面均显著低于模型组(P<0.01),但仍显著高于正常组(P<0.01),中药1组、中药2组、西药组较中药3组显著升高(P<0.01)。脂代谢方面,药物干预8周后,各中药干预组在TC、TG、LDL-C、HDL-C均无组间差异;TC、TG、LDL-C方面,各中药干预组较模型组TC显著降低(P<0.01),西药组较模型组则无明显差异(P>0.05);HDL-C方面,各中药干预组较模型组显著升高(P<0.01),西药组较模型组无明显差异(P>0.05)。IR方面,各药物干预组均较模型组显著降低(P<0.01),较正常组显著增加(P<0.01),各药物干预组间差异无统计学意义(P>0.05)。3、AGEs-RAGE途径,各造模组在药物干预8周后AGEs浓度较正常组显著增多(P<0.01),其中模型组增幅最多(P<0.01),中药1组较中药2组无明显差别(P>0.05),西药组、中药3组较中药1组、中药2组显著减少(P<0.01),中药3组较西药组无明显差异(P>0.05),免疫组化IOD值方面与胸主动脉AGEs ELISA检测含量结果变化一致,图像显示,AGEs在各组大鼠胸主动脉中呈棕黄色颗粒沉淀,其中,正常组可见散在稀疏棕黄色颗粒沉淀,染色较浅;模型组则在内皮层、平滑肌层、血管壁间质均可见大量棕黄色颗粒沉淀,染色极深;各药物干预组棕黄色沉淀染色较模型组浅,但较正常组深;中药3组、西药组较中药1组、中药2组、染色浅,其中中药3组棕黄色颗粒主要沉淀在内皮层,平滑肌层仅见稀疏、浅染棕黄色颗粒;中药1组、中药2组、西药组内皮层、平滑肌层均可见深染棕黄色颗粒沉淀,其中中药1组、中药2组较西药组棕黄色颗粒沉淀增多。RAGE mRNA方面,各药物干预组较模型组显著减少(P<0.01),中药1组较中药2组无明显差别(P>0.05),西药组较中药1组显著减少(P<0.01),中药2组、中药3组较西药组无明显差别(P>0.05)。4、氧化应激:各组在SOD、CAT、GSH-Px中的变化趋势,组间比较大致相同。正常组较各造模组显著升高(P<0.01),各药物干预组较模型组显著升高(P<0.01),中药3组较中药1组、中药2组、西药组显著升高(P<0.01),中药1组、中药2组较西药组无明显差异(P>0.05)。p47phox mRNA方面,各造模组在干预8周后仍较正常组显著升高(P<0.01),中药1组较模型组降低(P<0.05),中药2组、中药3组、西药组较模型组显著降低(P<0.01),中药3组较中药1组、中药2组、西药组显著降低(P<0.01)。5、内皮功能:在eNOS mRNA表达上,正常组较各造模组显著升高(P<0.01),模型组较各药物干预组显著降低(P<0.01),中药3组较中药1组、中药2组、西药组显著升高(P<0.01),中药1组、中药2组较西药组无明显差异(P>0.05)。在ERK1、ERK2表达上,各组组间比较及变化趋势相近,western blotting检测结果显示,正常组较各造模组显著降低(P<0.01),各药物干预组较模型组显著降低(P<0.01),中药1组、中药2组、中药3组较西药组显著降低(P<0.01),中药1组、中药2组较中药3组无明显差异(P>0.05)。6、胸主动脉病理形态:HE染色方面,正常组显示内皮层各细胞链接紧密,无脱落,无肿胀变性,无泡沫细胞形成,平滑肌层亦链接紧密,无异常增殖。模型组显示内皮层细胞脱落严重,细胞肿胀明显,可见泡沫细胞、巨噬细胞,平滑肌层结构紊乱,平滑肌细胞明显增殖,在内皮层可见纤维帽形成;中药1组、中药2组、中药3组、西药组病变情况较模型组减轻;中药1组显示内皮细胞脱落、肿胀,内皮层可见少量脂质沉积,少量泡沫细胞形成,平滑肌层细胞链接紊乱,可见细胞异常增殖,但未见纤维帽形成;中药2组显示内皮细胞稍肿胀,病变程度较中药1组稍减轻,未见明显泡沫细胞、纤维帽形成,平滑肌层可见细胞异常增殖,细胞链接不规律;中药3组显示内皮层细胞轻微肿胀,但各细胞间链接尚密切,未见明显泡沫细胞、纤维帽形成,病变程度较中药1组、中药2组、西药组减轻,平滑肌层亦未见明显异常增殖;西药组显示内皮层细胞稍肿胀,可见少量泡沫细胞形成,未见纤维帽形成,平滑肌细胞排列紊乱、松散。电镜结果显示,正常组胸主动脉各内皮细胞链接紧密,内皮细胞紧贴内皮下层,细胞膜完整光滑,细胞内各结构正常;模型组内皮细胞坏死并脱落,呈空泡样,细胞内各结构消失溶解;中药1组显示内皮细胞变性损伤,细胞膜破坏,细胞内结构模糊,并与内皮下层形成间隙;中药2组显示内皮细胞细胞膜损伤,但仍能清楚看到细胞核;中药3组显示内皮细胞水肿、损伤,损伤程度较中药1组、中药2组、西药组轻,细胞内各细胞器尚清晰;西药组显示内皮细胞细胞膜变性损伤较严重,细胞内各细胞器不清晰,但较模型组损伤程度轻。结论:在改善一般情况方面,加味桃核承气汤能够有效降低减少T2DM大血管病变大鼠摄水量、摄食量,并有效增加大鼠体重;血糖方面,加味桃核承气汤能够通过改善胰岛素抵抗、降低FPG、HbAlc起到平稳降糖的效果;血脂方面,加味桃核承气汤能通过降低TG、TC、LDL-C,升高HDL-C起到改善脂质代谢的效果;在保护大血管病变方面,加味桃核承气汤能够通过AGEs-RAGE途径,降低AGEs生成,降低受体RAGEmRNA的表达,从而抑制AGEs-RAGE系统,并通过增加血清SOD、CAT、GSH-Px水平,降低p47phox mRNA表达,修复机体抗氧化应激能力,最后通过增加eNOS mRNA,减少ERK1/2蛋白表达,起到改善内皮功能、减少血管平滑肌细胞异常增殖、延缓动脉粥样硬化进展的效果。此外,本次实验亦发现西药氨基胍虽能有效降低AGEs生成,但其延缓AS的作用较弱,说明DM大血管病变的机制仍然是多靶点的,今后仍需要大样本、多中心的实验研究进一步证实。另一方面,组间比较结果显示,中药3组相较于中药1组、中药2组、西药组能够更有效抑制AGEs-RAGE通路、修复抗氧化应激能力、更有效地延缓AS的进展,究其深入的中医学理论,中药3组较其余两组主要加强了"温运阳气"的作用,体现了 DM大血管病变的病机除气阴不足、瘀热互结外,还具有阳失健运的特点,这提示了今后中医药在治疗DM大血管病变过程中除注重既往的益气养阴、活血化瘀外,还应重视"温运阳气",这为中医药防治DM大血管病变奠定了重要的理论基础,有待今后临床与实验研究进一步证实。