目的:1.白头翁属Pulsatilla Miller的分类问题一直是相关学者研究的热点话题,最早白头翁P.chinensis被归于银莲花属Anemone L.,之后白头翁又被单独分为白头翁属。目前,白头翁药材主要依靠野生资源,栽培技术十分有限。在药材需求量连年增加的趋势下,面临着白头翁药材供应不足的困境。因此,很有必要对白头翁的资源分布及白头翁属植物分类作系统阐述,同时进行白头翁属植物的种子萌发探究,为白头翁栽培育种技术的开发奠定基础。2.由于正品白头翁药材资源不足,加之外观形态特征等传统鉴定方法很难对白头翁药材及伪品准确鉴定,因此白头翁药材的质量评价及鉴定研究十分迫切。采用高效液相色谱（HPLC）指纹图谱和分子生物学技术,为白头翁的质量评价及准确鉴定提供有效方法。材料与方法:1.材料:白头翁属植物种子14份,白头翁属植物新鲜叶片6份,药材94份,白头翁地上部分10份,分别收集于辽宁省药用植物重点物种保存圃、河南省驻马店市、辽宁省鞍山市千山、辽宁省凤城市、黑龙江省伊春市、内蒙古自治区通辽市,均由辽宁中医药大学康廷国教授、许亮教授鉴定。2.方法:2.1通过查阅《中国植物志》、Flora of china及相关文献,对中国白头翁属植物进行系统分类。查阅相关文献资料整理出我国白头翁属植物资源地域分布情况。同时根据白头翁属植物标本在国内7所不同地域范围的大型植物标本馆中的馆藏情况,整理了已搜集的白头翁属植物标本数量及种类。2.2计算白头翁属植物种子的千粒重,对白头翁属植物种子进行萌发实验。2.3参照2020年版《中国药典》及相关文献,采用HPLC法测定60批不同组别白头翁属3种药材的指标性成分白头翁皂苷B4的含量。首先将白头翁、朝鲜白头翁、兴安白头翁3种药材各分为大、小两组,对它们的长度、直径、重量进行测定,并对不同种药材及同种药材不同组别之间的含量进行比较。2.4建立30批白头翁药材及10批白头翁地上部分的HPLC指纹图谱,根据所得色谱图对各样品进行质量评价并比较分析。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所得的指纹图谱全谱计算相似度,采用中位数法生成对照图谱,比对已知化学成分,计算共有峰保留时间及峰面积比值。2.5采用Illumina Hiseq测序平台对6种白头翁属植物的叶绿体基因组进行测序、组装、注释分析,对它们的基因组特征、简单重复序列、长重复分析、IR区域边界、核酸多样性进行比较分析。采用邻接法（NJ）构建基于叶绿体全基因组和51个共享蛋白编码的系统发育树,从分子水平上阐述白头翁属植物在毛茛科植物中的系统发育位置。2.6通过高通量测序技术对4种白头翁药材不同比例混合粉末进行鉴定,样品比例分别为1:1:1:1、4:1:1:1、8:1:1:1、16:1:1:1,利用宏基因组学策略进行分析,使用MEGA 6.0对NCBI数据库选取的白头翁属ITS2序列进行比对,筛选出的OTU代表序列进行分析并鉴定。通过丰度分析,探究测序各样品量与所得序列条数的相关性。结果:1.通过查阅相关文献可知,1753年林奈在Species Plantarum里首次将白头翁归于银莲花属,命名为Anemone pulsatilla。现白头翁被归于白头翁属,命名为Pulsatilla chinensis。1922年发表的文献中,有学者认为金县白头翁是白头翁和朝鲜白头翁的杂交种,现金县白头翁作为白头翁的变种收载于《中国植物志》。我国共有白头翁属植物11种6变型2亚种5变种,共计24种。2.通过文献的收集整理,发现中国白头翁属植物在我国20个省均有分布。白头翁作为唯一法定正品药材来源,在我国辽宁、吉林、黑龙江、河北等16个省均有分布,且东北地区分布最为广泛。7所国内不同地域范围的大型植物标本馆中,共收藏中国白头翁属植物11种,3变种,2变型,共16种。7所标本馆共收藏国外白头翁属植物27种、4亚种、5变种、7变型,共43种。3.白头翁属各植物种子的外观形态及其相似,但从种子大小,宿存花柱的长度上来看,它们仍有细微差别。种子萌发实验显示,白头翁、朝鲜白头翁、兴安白头翁、灰花白头翁、金县白头翁、细叶白头翁种子的发芽周期分别为25天、23天、26天、26天、25天、24天,发芽率分别为31.33%、78.67%、74.00%、75.33%、32.00%、36.00%,发芽势分别为23.33%、30.00%、56.00%、42.00%、24.00%、32.00%。陈年的白头翁和朝鲜白头翁种子均未发芽。4.HPLC法测定3种白头翁药材不同组别共60批样品的白头翁皂苷B4含量。白头翁大组药材中白头翁皂苷B4的平均含量为6.223%,小组药材中白头翁皂苷B4的平均含量为5.189%。白头翁药材中白头翁皂苷B4含量最高为8.42%,最低为2.88%。朝鲜白头翁和兴安白头翁测得白头翁皂苷B4的含量极低,均不符合《中国药典》规定。5.建立3种白头翁药材及白头翁地上部分各10批样品的HPLC指纹图谱,白头翁药材样品有21个共有峰,朝鲜白头翁药材样品有25个共有峰,兴安白头翁药材样品有17个共有峰。3种白头翁药材有9个共有峰。白头翁和朝鲜白头翁共比对到白头翁皂苷E、白头翁皂苷H、白头翁皂苷B4、白头翁皂苷E3、白头翁皂苷E1这5种化学成分。兴安白头翁与两者相似,但未能鉴定出白头翁皂苷E1。白头翁地上部分指纹图谱色谱峰与白头翁药材有很大差异。6.通过对6种白头翁属植物叶绿体基因组测序比较,发现它们具有相似的基因组大小,但与同科植物乌头与黄连差异较大。叶绿体基因rpl16和rps12等大小存在一定差异。其中,兴安白头翁含有6种核苷酸,其他5种白头翁属植物含有除六核苷酸以外的5种核苷酸。长重复分析中,在6种白头翁属植物的叶绿体基因组中发现了49、49、38、38、49和49对长重复序列。此外,它们的IR区大小非常相近,但与乌头和黄连的IR区差异较大。叶绿体基因组的核苷酸多样性分析显示,共有108个编码基因和105个非编码基因,rpl36基因和ccs A-ndh D区作为两个显著的变异位点可用于分子标记的开发。利用植物叶绿体全基因组和51个共享蛋白编码基因构建NJ系统进化树,白头翁属植物聚为一支,更好的体现了它们在毛茛科植物中的系统进化位置。7.基于高通量测序技术对4种白头翁药材不同比例混合粉末的鉴定研究,共得到391381条有效序列,其中长度为363 bp的序列条数最多为266851条。从Gra Phl An的样本总体分类等级树图中可以看出,白头翁属物种的相对丰度很大,属于优势类群。在科、属水平的物种相对丰度分析中可以看出,毛茛科、白头翁属物种的相对丰度远大于其他科、属物种的相对丰度。在种水平上可以看出,白头翁药材的相对丰度在所有物种中最大,其次是朝鲜白头翁药材。结论:1.通过文献整理,对中国白头翁属植物分类有了系统认识。白头翁分布于全国各地多个省份,东北地区作为主产区有大量分布。尽管如此,正品白头翁药材仍供不应求。在这样的情况下,建议加强白头翁药材的资源管理,大力发展正品白头翁药材的栽培,以减少药材供应不足、伪品药材滥用等现象的出现。2.通过标本馆考察及资料搜集发现,中国科学院植物研究所标本馆中收藏白头翁属植物标本种类及数量最多,中国科学院武汉植物园标本馆仅收集1份白头翁植物标本,中国科学院武汉植物园标本馆和西北农林科技大学植物标本馆中均未收藏国外白头翁属植物标本。这些信息可为白头翁属植物的分类及资源分布研究提供实际意义。3.白头翁属植物种子的外观形态十分相似,只有细微差别。细叶白头翁和金县白头翁种子个体相对较大,这与外观形态特征描述结果一致。种子萌发实验表明,陈年的白头翁种子及朝鲜白头翁种子均未发芽,证明第二年的种子完全丧失活力。此实验探究为白头翁种子的萌发及繁育研究提供参考。4.采用HPLC法测定3种白头翁药材中白头翁皂苷B4的含量,实验结果从药材性状和指标性成分含量的关系上验证了《中华本草》中对白头翁药材“以条粗长,质坚实者为佳”的质量评价。从指标性成分白头翁皂苷B4含量的角度考虑,朝鲜白头翁和兴安白头翁不能替代正品白头翁药材使用。5.通过构建HPLC指纹图谱,白头翁和朝鲜白头翁检测出的色谱峰数量较多且较为相似,两者可能含有更相似的皂苷类成分。3种白头翁药材及白头翁地上指纹图谱存在一定的差异,可为它们的质量评价及混伪品鉴别提供有效方法。6.采用Illumina Hiseq测序平台对6种白头翁属植物的叶绿体基因组进行测序分析,超级条形码技术的应用可以找出6种白头翁属植物在分子水平上的差异,从而用于白头翁属物种的鉴定。NJ系统进化树的构建,展示了白头翁属植物在毛茛科中的进化位置,为进一步研究白头翁属植物的进化史提供了参考依据。7.ITS2序列可用于鉴定白头翁属近缘药材。细叶白头翁和兴安白头翁的相对丰度与测序样品的量呈正向相关,虽然白头翁和朝鲜白头翁相对丰度很大,但未呈现一定的相关性。本实验可为白头翁属药材的鉴定提供有效的方法,为药材混合粉末的鉴定提供新思路。