论文部分内容阅读
应用组织工程方法来提高周围神经损伤的修复效果已成为当前神经修复领域的研究趋势。理想的组织工程人工神经是一种具有特定的三维结构的神经导管,可接纳再生轴突长入,对轴突起引导作用,雪旺细胞在其中有序地分布,分泌神经营养因子等来发挥神经营养作用,并表达细胞粘附分子、分泌细胞外基质(extracellular matrix.ECM)支持并引导轴突再生。本文拟通过成分仿生和结构仿生两个角度来设计和构造神经组织工程支架,进而达到功能仿生的目的。成分仿生方面,本文以天然马尾神经组织细胞外基质(cauda equine-derived extracellullar matrix,cc-ECM)和脐带细胞外基质(Wharton’s jelly ECM, wj-ECM)为基本原材料制备神经组织工程支架。其中马尾神经ECM保留了能促进神经修复的具有特异性的生物活性成分；而脐带ECM来源于胚胎组织,免疫原性低,能够延缓细胞衰老，使细胞保持活力持续增殖并分化。结构仿生万而,本文通过将马尾神经细胞外基质与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(1-lactide-coglycolide).PLGA)复合的方法,采用电纺丝技术制备取向纳米纤维支架,提高复合支架力学性能的同事保持ECM的生物活性。同时,将脐带细胞外基质与天然纳米细菌纤维素(bacterial ccllulose.BC)的改性衍生物复合,通过定向结晶冷冻干燥的方法制备了取向多孔支架,为组织修复提供了合适扎隙结构，这就从结构和成分仿生两个角度为细胞外基质在神经组织修复中的应用提供了可能。本文具体研究工作和结果如下：通过Triton X-100和脱氧胆酸钠化学萃取去细胞联合差速离心的方法,制备出天然马尾神经来源的ECM：对ECM中核物质残留情况进行染色观察和定量表征,表明ECM去细胞程度较好，不具备免疫原性;生化成分定量检测证明ECM中胶原和葡萄糖氨聚糖(sulphated glycosaminoglucans,sGAG)成分得到保留；组织染色和免疫荧光染色观察表明ECM中含有丰富Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白等多种天然神经细胞外基质成分,这就奠定了成分仿生的基础。将马尾ECM与合成共聚物PLGA复合,通过电纺丝力法制备取向周围神经组织工程支架：扫描电镜、红外光谱和双光子显微镜照片证实了纤维支架中ECM成分的存在以及取向结构；拔触角测试证明复合纤维支架具有良好的亲水性；雪旺细胞(Schwann cells、SCs)培养表明，取向结构对SCs的生长具有定向引导作用,且SCs在复合支架上的生长更接近正常细胞形态,证明了ECM成分对神经细胞具有更好的表型维持作用；背根神经节(dorsal root ganglions, DRGs)培养证明,取向支架对神经纤维的生长同样具有引导作用,证明了其良好的神经组织相容性。将脐带ECM分别与双醛基(dialdehyde BC, DBC)和羧甲基改性(carboxymethye BC. CMBC)的细菌纤维素复合,通过定向结晶冷冻干燥法制备取向多孔支架。微观形貌观察表明支架具有微米级的连通孔隙；免疫荧光染色表明两种复合支架中ECM分布均匀,且保留了胶原蛋白、层粘连蛋白等ECM中的生物活性成分；在多孔支架上培养骨髓干细胞(Bone marrow stem cells, BMSCs),各组支架上细胞增殖良好,表明支架具有良好的细胞相容性。通过电镜观察表明BMSCs长入支架材料的孔隙中,且分泌出颗粒状的细胞外基质类物质。结果表明支架具备负载种子细胞的能力,具有潜在的神经组织工程应用价值。上述研究表明,本文制备的ce-ECM/PLGA复合电纺取向纤维支架、wj-ECM/DBC多孔支架以及wj-ECM/CMBC取向多孔支架能够从成分仿生和结构仿生的角度模拟天然细胞外基质,为细胞外基质材料在神经组织工程领域的应用奠定了理论依据和实验基础。