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随着新冠肺炎病毒疫情的爆发,病原体引起的感染性疾病再次成为全球关注的热点。核酸扩增检测具有敏感识别靶序列的能力,在疾病确诊中发挥了重要作用。通过整合微流控技术与核酸检测技术,可将核酸检测过程在一块微小且封闭的微流控芯片实验室上进行集成,使非专业技术人员也可以在传统的分子诊断实验室以外的环境中进行核酸即时检测（Point-of-caretesing,POCT）。作为核酸分析的首要步骤,核酸提取环节直接决定了处理样本的类型以及模板质量。常用的核酸提取方法主要包酚-氯仿提取法为代表的液相萃取法,和以硅胶膜和磁珠微球为代表的固相萃取方法等。目前存在的主要问题是:（1）主要以高比表面积的固相介质（磁性微球或硅胶模）为基础,提取过程繁琐、耗时长;（2）未充分利用微流控芯片本身材料的本征特性进行核酸提取,仅将其作为传统核酸提取试剂的载体,结合复杂的阀、泵设计和操控进行病原体核酸检测,芯片设计复杂度和制造成本较高,配套的仪器设计难度和检测成本也随之提升。针对上述问题,本文的重点聚焦于研究如何利用微流控芯片的本征特性完成核酸高效提取,简化芯片上核酸检测操作过程,降低芯片设计复杂程度。因此,本文创新性地提出了基于SIMPLE chip的病原体核酸检测新方法（也称为简单芯片）,特点如下:（1）利用芯片通道本身作为核酸富集介质,不再利用传统高比表面积（Surface area-to-volume Irrespective）的磁珠或硅胶膜富集核酸;（2）在芯片通道内修饰聚合物材料壳聚糖（Modified chambers）,通过优化核酸结合液体系,以低成本的方式特异性地实现病原体核酸现场快速提取（Point-of-careand Low-cost-based Extrcation）;3)壳聚糖修饰芯片富集核酸后无需洗脱核酸,简化了病原体核酸检测流程,且非常适合检测低丰度的核酸。本文主要工作内容如下:（1）开展了基于低成本聚合物材料的SIMPLE chip制备关键工艺研究,为实现病原体核酸的高效富集和原位扩增检测奠定了芯片基础。首先,设计了一款三明治结构的SIMPLE chip,主体结构由“玻璃基底-PDMS薄膜-PMMA主体”,芯片主体上集成了 4个低比表面积的腔体用于核酸富集和原位扩增检测;随后,开展了基于激光切割技术的SIMPLE chip单元结构制备工艺研究,重点研究了激光参数对单元结构切割效果的影响,结果表明离焦距离为1 mm、切割速度为10%、激光频率为5000 Hz、激光脉宽为30μs时,所制备的SIMPLE chip各个单元结构特征（孔径/边缘粗糙度）满足芯片组装及键合要求。随后,重点探究了热压辅助氧等离子体键合方法,实现了“玻璃基底-PDMS薄膜-PMMA主体”的快速键合,完成了SIMPLE chip的制备,单个芯片制备周期小于8 min。流体冲击和升降温测试结果表明,SIMPLE chip不仅SIMPLE chip可以耐受超过其腔体体积10000倍的流体快速流入和流出带来的冲击,同时可以耐受45个PCR扩增循环过程中快速升降温带来的冲击,而不会发生任何试剂泄露现象,为病原体核酸的原位扩增检测奠定了基础。为实现低比表面积芯片腔体中病原体核酸的高效富集,利用核酸天然带负电荷的原理,探究了高分子聚合物材料壳聚糖（一种带正电荷的材料）修饰SIMPLE chip关键工艺,辅以亲水角、AFM、FTIR和XPS等表征手段证明了SIMPLE chip被壳聚糖成功改性,且改性SIMPLE chip依然是以低比表面积为特征,并证明了改性SIMPLE chip无扩增抑制现象。（2）开展了基于SIMPLE chip的核酸提取-原位扩增检测方法研究,实现了SIMPLE chip上病原体核酸的高效富集和原位扩增检测。首先,采用批式实验方法,探究了不同实验条件（富集时间、离子环境等）在单一及共存条件下,SIMPLE chip富集核酸的宏观规律,确定了其对病原体核酸的富集性能。吸附动力学结果表明SIMPLE chip在2 min内即可达到最大核酸吸附量,核酸吸附能力为105-130ng/cm2,富集效率约为75%,表明SIMPLE chip具有富集核酸速度快、负载量高的优点。SIMPLE chip富集核酸后,可以直接进行原位扩增检测,无需洗脱核酸,检测灵敏度较未优化体系的SIMPLE chip提高了 4000-8000倍,比传统商业化核酸提取试剂盒提高了 4～10倍。（3）研发了与SIMPLE chip相互匹配的智能手机病原体核酸检测系统,解决了常规病原体核酸检测方法需要专业实验室和专业技术人员的问题。智能手机病原体核酸检测系统整合了温度控制单元、荧光检测单元、SIMPLE chip以及核酸检测所需的相关附件。检测系统重量约为1.5 kg,升降温速率分别为6.5℃/s和5.59℃/s,温度均匀性≤0.1℃,可在1 h内完成45个扩增循环;TracePro的模拟结果表明中心区域峰值辐照度达到了 85%左右,具有良好的荧光均匀性,确保了SIMPLE chip的4个腔体具有一致的光学检测环境。POCT设备的扩增效率为106.8%,和商业化扩增仪处于同等水平。最后,采用寨卡假病毒评价了基于SIMPLE chip和智能手机的核酸提取-原位扩增检测方法,实验结果表明SIMPLE chip的灵敏度达到了 10 TU/mL,整体优于商业化核酸提取试剂盒和扩增仪,且在低浓度样本下（10-100 TU/mL）表现更为出色。综上所述,本文针对病原体核酸检测的现实需求,完成了基于低成本聚合物材料的SIMPLE chip制备关键工艺研究,同时研制了适用于SIMPLE chip的核酸提取-原位扩增试剂体系,并研发了与SIMPLE chip相互匹配的智能手机病原体核酸检测系统,实现了对唾液中的寨卡病毒的高灵敏度检测方法,为病原体核酸即时检测（Point-of-care testing,POCT）技术的发展提供了新方法和新思路。