背景肝性脑病是急性或慢性肝功能衰竭的神经精神并发症,氨中毒被认为是其病因之一,该病目前尚无特异治疗方法,以综合治疗为主。生物人工肝是由微载体粘附的肝细胞和人工解毒装置共同组成的体外肝灌流系统,是患者自体恢复肝功能的重要治疗方法,也是帮助患者过渡到肝移植的桥梁,在一定程度上缓解了肝性脑病。目前,生物人工肝的种子细胞来源是制约生物人工肝发展的首要问题,去氨作用是其核心要求。胆汁酸通过法尼酯X受体(FXR)调节脂质和葡萄糖的代谢,奥贝胆酸(OCA)作为一种胆汁酸的模拟物可活化FXR。近期研究发现,FXR能引起氨代谢通路中部分酶基因的改变。但是激活FXR是否可以促进生物人工肝种子细胞的氨代谢能力,使其更好的应用到生物人工肝系统尚未见报道。此外,活化FXR对肝损伤所致的肝性脑病是否有治疗作用,也值得进一步探讨。目的1.检测活化FXR对生物人工肝种子细胞氨代谢能力的影响,进一步开发高效生物人工肝系统。2.探讨活化FXR对小鼠氨代谢及肝性脑病的作用。方法细胞实验:1.生物人工肝种子细胞C3A的生物学改造:(1)C3A细胞系转染FXR稳转质粒,通过G418筛选,建立C3A-FXR稳转细胞株,RT-PCR、细胞荧光检测FXR过表达效率。(2)转染精氨酸酶1(ARG1)和鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OTC)质粒,恢复C3A细胞的氨代谢通路。2.C3A细胞的氨代谢和耐氨毒能力检测:(1)RT-PCR检测氨代谢通路关键酶基因的表达水平。(2)加入20 mM NH4Cl建立氨胁迫环境,使用实时无标记细胞分析仪(RTCA)检测细胞增殖能力来评价其耐氨毒能力。(3)生化分析仪检测不同处理后细胞上清中尿素的含量,评估生物人工肝种子细胞的氨代谢能力。动物实验:1.肝性脑病动物模型的建立:选取12周龄C57BL/6N野生型雄性小鼠,连续3天腹腔注射硫代乙酰胺(TAA)200 mg/kg/天建立TAA模型;肝脏大部分切除术(PHx)建立肝切模型。生化分析仪检测这两个模型血浆中血氨、尿素含量及肝功能指标;HE染色和免疫组织化学分析肝脏和大脑的病理改变。2.活化FXR对氨代谢的影响:小鼠腹腔注射TAA前一天开始使用FXR激动剂OCA 25mg/kg/天进行灌胃处理,三天后处死小鼠,取血浆、肝脏和大脑;对WT和FXR-KO小鼠进行大部分肝切手术,分别在术后40 h、3d和7d处死小鼠,取血浆,肝脏和大脑。(1)RT-PCR检测FXR的靶基因验证FXR的激活;(2)生化分析仪检测血浆中血氨、尿素含量及肝功能指标ALT,AST,TBA等;(3)HE染色和免疫组织化学分析肝脏的病理改变;(4)RT-PCR及Western blot检测氨代谢通路关键酶基因的表达。3.活化FXR对肝性脑病的影响:小鼠腹腔注射TAA前一天开始连续使用OCA 25mg/kg/天进行灌胃处理,三天后处死小鼠。(1)旷场实验检测肝性脑病所致小鼠行为学改变;(2)处死小鼠后取大脑,RT-PCR检测脑中肝性脑病相关因子的基因表达;(3)HE染色和免疫组织化学分析大脑皮质及海马的病理改变。结果1.生物人工肝种子细胞C3A的生物学改造:C3A细胞转染FXR稳定表达质粒后,FXR及其下游靶基因的表达水平显著升高。在LO-2,HepG2,C3A这三种细胞系中,氨代谢通路关键酶基因ARG1,OTC明显低表达,甚至缺失,我们在C3A-FXR细胞中过表达ARG1和OTC,在激活FXR的同时恢复氨代谢通路。2.活化FXR提高C3A细胞的氨代谢以及耐氨毒能力:RT-PCR结果显示,活化FXR可以上调氨代谢通路关键酶基因的表达,其中以NAGS和SLC1A4尤为明显。RTCA结果显示,NH4Cl浓度越高,其对细胞增殖的抑制作用越明显,但细胞过表达FXR后,NH4Cl对细胞增殖能力的抑制效果明显下降,细胞耐氨毒能力增强。细胞培养72 h后取上清进行生化检测,发现激活FXR后尿素生成增加,并且在氨胁迫状态下,激活FXR同样可以增加尿素生成量。3.活化FXR并恢复氨代谢通路中的关键酶ARG1和OTC后对C3A细胞的氨代谢以及耐氨毒能力的影响:活化FXR并恢复氨代谢通路后,细胞的耐氨毒能力并没有出现叠加效应,尿素的生成亦呈现同样的趋势。4.肝性脑病动物模型的建立:(1)TAA模型生化结果显示,血浆中ALT、AST和血氨浓度均显著升高;肝脏HE染色显示,腹腔注射TAA后,肝细胞桥接坏死伴大量炎细胞浸润,大脑皮质及海马区星形胶质细胞增多,肿胀;脑免疫组织化学结果显示,星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及脑免疫细胞小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白分子1(IBA1)的表达明显升高。(2)肝切模型生化结果显示,肝切后血浆中ALT、AST、TBA和氨浓度均有显著升高,尿素的含量降低,其中以肝切后40 h变化最大,随着肝脏的再生,7 d后肝功能基本恢复;免疫组织化学结果显示,肝切后大脑中GFAP及IBA1的表达升高。5.活化FXR提高小鼠的氨代谢水平:在TAA模型中,生化结果显示小鼠饲喂OCA活化FXR后血浆中ALT、AST和血氨水平较TAA组均有显著下降;HE染色显示,活化FXR后肝细胞炎症和坏死区域显著减少;此外,注射TAA后,小鼠氨代谢相关基因的表达水平大多显著下调,饲喂OCA激活FXR后,这些基因表达有明显的回升。同时,Western blot结果显示,注射TAA后,NAGS,AS蛋白表达降低,饲喂OCA后NAGS,AS蛋白表达水平上调。肝切模型中,相较于WT小鼠,FXR-KO小鼠的肝功能受影响更严重,表现为肝切后血浆中ALT,AST和TBA含量较WT小鼠均有显著升高,尿素含量在40h明显下降,但血氨水平则变化不显著;此外,肝切之后,氨代谢相关酶基因GS,CPS1,ARG1,AL,NAGS,SLC1A4d的表达水平显著上调,其中FXR-KO小鼠和WT小鼠的趋势是一致的。另外,和WT小鼠相比,FXR-KO小鼠中FXR的靶基因NAGS,SLC1A4和GLS的表达量是降低的。6.活化FXR改善肝性脑病:在TAA模型中,大脑病理损伤相关基因TSPO,MAO-A,GRIAL的表达水平显著升高,小鼠饲喂OCA活化FXR后,上述基因的表达有明显的下调。免疫组化结果显示,活化FXR后大脑海马和皮质区域GFAP和IBA1的表达均有明显下降,这说明活化FXR对肝性脑病有明显改善作用。结论1.活化FXR提高生物人工肝种子细胞C3A的氨代谢及耐氨毒能力。2.活化FXR并恢复氨代谢通路未进一步增强C3A的氨代谢及耐氨毒能力。3.活化FXR能提高肝损伤小鼠的氨代谢能力,并有显著的肝保护作用。4.活化FXR能改善肝性脑病。