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大豆(Glycine max L.Merr)是我国乃至全世界主要粮油作物之一,其蛋白和脂肪含量分别占大豆籽粒重的40%和20%。大豆油消费占全球植物油脂市场的1/3以上。随着大豆油作为食用油和制备生物燃油以及其他油脂化工品的需求日益增加,培育高油品种和提高大豆油产量始终是大豆遗传育种和大豆生产主攻领域。深入解析大豆种子油脂生物合成调控机制和鉴定参与油脂合成关键基因的功能,可为大豆油脂产量和品质遗传改良提供科学依据和油脂代谢基因工程分子靶标。植物种子储存的绝大多数油脂为三酰甘油(Triacylglycerols,TAG)。TAG合成过程中最后一步酰化反应的关键限速酶主要有两种酶系,即依赖于酰基-CoA的二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferases,DGAT,包括DGAT1、DGAT2和DGAT3)和不依赖于酰基-CoA的磷脂:二酰甘油酰基转移酶(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase,PDAT,包括PDAT1和PDAT2)。DGAT将结合于CoA分子的脂肪酸酰基转移到二酰甘油(sn-1,2-diacylglycerol,DAG)的sn-3位置生成TAG。然而,PDAT则选择结合于磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)分子的脂肪酸酰基并将其转移到DAG的sn-3位置生成TAG。已有研究论证了大豆DGAT1和DGAT2家族成员的功能,有关大豆DGAT3和PDAT1家族成员及功能鲜见报道。为此,本文全基因组鉴定大豆GmDGAT3和GmPDAT1家族成员,定量分析各成员的组织特异性表达谱。分子克隆在发育种子中高表达的DGAT3和PDAT1编码序列,构建它们的酵母表达载体和植物组成型表达载体,通过TAG合成缺陷型酵母功能互补试验和烟草瞬时表达,检测这些GmDGAT3和GmPDAT1对宿主细胞油脂合成及脂肪酸组成的影响,分析它们的酶活性及生物学功能。研究将获得全面解析大豆种子油脂生物合成分子机制的新知识,有助于建立大豆等油料作物种子油脂的遗传改良新策略。主要研究结果如下:1.分别以拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtPDAT1和花生(Arachis hypogaea)AhDGAT3编码序列为探针,对大豆基因组数据库进行BLAST分析,共鉴定获得6个大豆GmPDAT1基因(命名为GmPDAT1-A~F)和2个GmDGAT3基因(GmDGAT3-1和GmDGAT3-2)。分别以拟南芥AtPDAT1和花生AhDGAT3蛋白质序列为参照,多序列比对分析显示,大豆GmPDAT1s和GmDGAT3s酶蛋白均存在酰基转移酶底物结合位点,GmPDAT1s含有5个典型的PDAT酶蛋白家族保守结构域,GmDGAT3s具有6个典型的DGAT3酶蛋白家族的保守结构域。系统进化树表明,大豆GmPDAT1s分成3个亚组,分别与不同物种来源的PDAT酶蛋白序列相似性较高,而2个GmDGAT3酶蛋白聚合在一起,与刺毛黧豆(Mucuna pruriens)和木豆(Cajanus cajan)的DGAT3酶蛋白序列相似性较高。2.应用RT-PCR和荧光定量PCR(qRT-PCR),检测6个GmPDAT1s和2个GmDGAT3s在大豆(cv.Jack)不同组织器官中的表达谱。结果显示,GmPDAT1s和GmDGAT3s在大豆的根、茎、花、叶、豆荚和发育种子中均有表达,但在各组织中的表达量差异显著。GmPDAT1-B和GmDGAT3-2在发育种子中高量表达。3.应用高保真RT-PCR从大豆发育种子中成功克隆到GmPDAT1-B和GmDGAT3-2的编码序列。分别构建GmPDAT1-B和GmDGAT3-2的酵母表达载体(pYES2-GmPDAT1-B/GmDGAT3-2),并将其转入酿酒酵母TAG合成缺失突变株H1246细胞。分析阳性转基因酵母细胞的总油脂及脂肪酸成分显示,GmPDAT1-B和GmDGAT3-2过表达都能使H1246菌株恢复TAG合成功能。与转空载的H1246酵母相比,转基因酵母细胞含油量分别提高1.66倍和1.42倍。GmPDAT1-B导致酵母细胞积累较多的饱和脂肪酸(棕榈酸16:0和硬脂酸18:0),然而GmDGAT3-2引起酵母细胞积累较多的单不饱和脂肪酸(棕榈油酸16:1和油酸18:1),预示着这2个酰基转移酶对脂肪酸酰基有不同的底物偏好性。4.分别构建GmPDAT1-B和GmDGAT3-2的植物组成型表达载体(pCAMBIA1303-GmPDAT1-B/GmDGAT3-2),通过农杆菌介导侵染法分别使其在烟草叶片组织瞬时表达。空载体侵染的烟草叶片用作对照。转基因烟草叶片RNA分子鉴定显示,GmPDAT1-B和GmDGAT3-2基因在烟草叶片组织中高效表达。对转基因瞬时表达的烟叶组织油脂含量及脂肪酸成分测定显示,与对照相比,表达GmPDAT1-B和GmDGAT3-2都能显著促进烟叶油脂合成积累,总油脂含量分别比未侵染和空载侵染的对照提高4.15倍和3.24倍(p<0.05)。转GmPDAT1-B烟草叶片中棕榈酸(16:0)下降8.20%,硬脂酸(18:0)升高7.62%,油酸(18:1)亦明显升高(p<0.05)。转GmDGAT3-2的烟草叶片16:0下降11.67%,18:1含量显著升高12.34%(p<0.05)。这表明GmPDAT1-B对18:0有较高底物偏好性,GmDGAT3-2对18:1有较高底物偏好性。总之,本研究首次克隆和鉴定获得了具有酰基转移酶活性和催化TAG合成的大豆GmPDAT1-B和GmDGAT3-2酶基因。GmDGAT3-2是继花生AhDGAT3功能鉴定后,第二个被实验证实具有DGAT酶活性的可溶性酶蛋白。这两个基因可作为大豆油脂改良的分子靶标,亦可转基因用于提高其他植物种子油脂产量和品质的育种实践。