论文部分内容阅读
背景非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）已经成为全球主要的肝脏疾病和重要的公共卫生问题之一。NAFLD疾病谱广,包括单纯性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）、NASH相关肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌等系列病理改变。NAFLD的病因和发病机理还有争议,既往的“两次打击学说（two-hit model）”被认为是解释NAFLD发病机制的经典学说,但近年来更倾向于“多重平行打击学说（multiple parallel hits model）,该学说在解释NAFLD发病机制方面占主导地位,认为肠道菌群紊乱及其导致的肠源性内毒素血症（intestinal endotoxemia,IETM）是导致肝脏持续性炎性损伤及NAFLD发生发展的关键“打击”环节。“肠-肝”轴失衡（包括肠道菌群紊乱、肠源性内毒素（lipopolysaccharide,LPS）过度产生、肠黏膜屏障通透性改变等）是NAFLD进程中的关键环节。在高脂膳食诱导下,机体肠道菌群紊乱,肠腔内革兰氏阴性菌过度生长并产生大量LPS,伴随肠道通透性增加,LPS可以通过损伤的肠道屏障进入血液循环,直至肝脏和机体全身,从而诱导肝脏炎症（如激活LPS-TLR4下游通路）及损伤。随着对“肠-肝”轴认识的不断深入,肠黏膜屏障功能在预防NAFLD发生中的作用被高度关注。肠黏膜屏障能够防止肠源性致病因子侵入和阻止肠道内细菌及内毒素的易位,被称为抵御肠源性致病因子的“第一道防线”。近年来研究发现,内源性大麻素系统（endocannabinoid system,ECS）与NAFLD发生密切相关,在介导肠黏膜屏障功能、调节肠黏膜通透性和IETM中起关键作用。ECS主要包括内源性大麻素受体（如CB1与CB2）、内源性大麻素样配体及其合成与降解的分子机制,其功能与调节机制复杂,可调节能量代谢、胃肠道功能、免疫系统反应、肝脏代谢等涉及多个器官系统。同时ECS与肠道菌群关系密切,有研究发现给予高脂诱导的小鼠肠道特殊菌群干预（例如Akkermansia muciniphila）,可直接调控肠道ECS的活性,并改善肠黏膜屏障功能,减少IETM发生。“肠道菌群-ECS”在维持肠黏膜屏障功能预防NAFLD发生中发挥十分重要的作用。NAFLD发生发展受到多因素影响,包括肠道菌群、基因遗传差异以及膳食干预等多因素。SIRT3是生物体线粒体功能必备的调节器,在慢性代谢性疾病中作用显著,例如NAFLD,糖尿病和胰岛素抵抗等。在人群中,SIRT3基因rs11246020变异与NAFLD发生风险相关,更易感于发生肝脏脂质变性及肝脏炎症,其表现为SIRT3的低酶活性。SIRT3敲除（SIRT3 knockout,SIRT3KO）小鼠与野生型129品系小鼠相比,经高脂喂养更快速造模,并更易出现程度严重的肝脏脂质蓄积,肝纤维化及炎症。综上所述,SIRT3基因敲除小鼠可作为研究非酒精性脂肪肝发病机制的良好模型,在高脂膳食下表现明显的肝脏脂肪变性及炎症。白藜芦醇（Resveratrol,RSV）是重要的天然多酚类化合物,主要食物来源有葡萄、花生和一些浆果类水果。近年来研究表明白藜芦醇具有抗NAFLD、改善脂代谢和胰岛素敏感性等生物学效应。因此,白藜芦醇可能成为防控NAFLD的理想植物化合物。然而,白藜芦醇在体内生物利用率极低、代谢和清除速率很快、且其血清有效浓度只有痕量水平。白藜芦醇的高生物学效应及其低生物利用率之间存在明显矛盾。近年研究发现,肠道菌群可通过调控能量代谢和肠道功能来调控ECS。预实验发现白藜芦醇可改善高脂诱导的大鼠肠道菌群组成,并调节结肠CB1和CB2表达水平。基于上述研究背景,本研究提出如下科学假说:白藜芦醇可能通过调节“肠道菌群-ECS”改善肠黏膜屏障功能预防HFD诱导的NAFLD发生。该课题首次报道白藜芦醇可通过“肠道菌群-ECS”维持肠道屏障功能从而改善NAFLD有益作用,将为预防NAFLD提供新的膳食营养干预策略,并为研究防控NAFLD新型药物研发提供科学依据。目的研究肠道菌群、ECS和SIRT3基因在高脂诱导的NAFLD发生发展中的作用及其相关性机制,并进一步阐明白藜芦醇通过调节“肠道菌群-ECS”改善肠黏膜屏障功能预防HFD诱导的NAFLD发生发展的作用机制,为防控NAFLD新型药物研发提供科学依据。方法（1）高脂饲料喂养雄性SIRT3基因敲除小鼠及野生型（WT）129系小鼠18周建立NAFLD模型。观察小鼠体重及肝指数变化,比较各组小鼠肝脏脂质蓄积、肝脏炎性浸润、病理学改变及血清学指标,比较肝脏葡萄糖代谢及脂质生成相关基因表达水平。检测小鼠肠道屏障通透性、肠道炎症状态及肠源性内毒素血症水平。检测结肠及肝脏组织中ECS受体CB1及CB2表达水平。通过16S rRNA基因测序、PCoA分析以及PICRUSt分析肠道菌群组成和功能差异,使用相关性heatmap图及RDA分析肠道菌群及各生理生化指标的相关性,重点分析肠道菌群、ECS和SIRT3在高脂饲料诱导的小鼠NAFLD发生中的相关性。（2）高脂饲料喂养雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠6周建立NAFLD模型。白藜芦醇（RSV）灌胃。广谱抗生素（Abx）干预实验在高脂干预6周造模后,Abx加于饮水中干预4周。ECS抑制剂/激动剂干预实验在高脂干预6周造模后,分别采用CB1激动剂ACEA、CB2抑制剂AM630和溶剂对照组vehicle腹腔注射干预4周。观察RSV对大鼠体重及肝指数变化,比较各组大鼠肝脏脂质蓄积、肝脏炎性浸润、病理学改变及血清学指标。检测大鼠细菌易位、肠道屏障完整性、肠道屏障通透性、肠道炎症状态及肠源性内毒素血症水平。检测结肠中CB1、CB2以及ECS相关配体合成降解酶表达水平。通过16S rRNA基因测序、PCA分析、LEfSe分析以及PICRUSt分析肠道菌群组成及功能,使用相关性heatmap图及RDA分析肠道菌群及各生理生化指标的相关性。通过抗生素干预实验检测肠道菌群和ECS在RSV改善高脂诱导NAFLD发生发展中的作用,通过ECS抑制剂/激动剂干预实验阐明CB1和CB2分别在RSV改善肠道屏障和减轻肠道炎症中的作用。进一步分析“肠道菌群-ECS”在白藜芦醇调节肠道屏障功能、改善高脂诱导的大鼠NAFLD发生中的作用。结果（1）肠道菌群、ECS和SIRT3在高脂饲料诱导的小鼠NAFLD发生发展中起重要作用,高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂肪变性和炎症反应、肠道菌群紊乱和肠道屏障功能下降、CB1表达增加等变化在SIRT3缺失情况下更加显著,提示肠道菌群、ECS可能成为防控NAFLD的重要干预靶点。（1）高脂喂养导致WT小鼠和SIRT3KO小鼠肝脏脂肪变性及肝脏炎症显著增加,肝脏及血浆中TG和T-CHO水平、血浆ALT和AST活性、血浆TNF-α和IL-6含量显著上升,胰岛素抵抗明显增加,肝脏葡萄糖代谢及脂质合成相关基因表达水平明显提高。高脂组小鼠出现明显肠道屏障破损及肠道炎症发生。高脂组小鼠肠道菌群紊乱,其中脱硫弧菌（Desulfovibrio）、肠道通透性及黏膜完整性相关的Oscillibacter和Mucispirillum相对丰度显著性升高,短链脂肪酸产生菌Alloprevotella、LachnospiraceaeNK4A136group相对丰度显著降低。同时,高脂喂养小鼠血浆及肝脏LPS水平显著上升,结肠及肝脏中CB1表达水平显著增加。上述NAFLD表型、肠道菌群紊乱及肠源性内毒素血症在SIRT3KO小鼠中更为显著。（2）相关性分析发现Desulfovibrio的丰度与血浆LPS浓度,肝脏TG含量以及结肠CB1的mRNA表达量之间呈正相关;产短链脂肪酸的Lachnospiraceae科与结肠ZO-1及occludin的mRNA表达水平之间呈正相关。（2）“肠道菌群-ECS”在白藜芦醇调节肠道屏障功能、改善高脂诱导的大鼠NAFLD发生发展中起关键作用,白藜芦醇通过调节肠道菌群稳态减少肠内LPS产生,同时抑制结肠CB1减少肠道通透性及活化CB2减轻肠道炎症,最终减少肠源性LPS导致的肝脏脂肪变性和炎性损伤,延缓NAFLD发生发展。（1）高脂诱导的大鼠NAFLD模型中发现,大鼠体重、肝指数、肝脏脂肪变性及炎症表型显著增加,大鼠肠道屏障破损、肠道炎症显著,上述症状可被RSV逆转。RSV可减轻高脂干预大鼠的肠源性内毒素血症（血浆LPS）、减少细菌易位及增加肠道紧密连接蛋白（occludin、ZO1和claudin1）的表达,减轻肠道炎症症状（显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6,增加IL-10表达）,降低末端结肠LPS下游通路FAK/MyD88/IRAK4的表达。同时RSV可重塑肠道菌群结构的紊乱状态,通过增加Akkermansia muciniphila,短链脂肪酸产生菌Ruminococcaceae,和Lachnospiraceae相对丰度,并且降低LPS产生菌Desulfovibrio的相对丰度来实现。（2）通过抗生素干预实验消除肠道中大部分肠道菌群后,发现RSV对大鼠NAFLD的保护作用被削弱。抗生素干预后,RSV对大鼠体重、血浆TG和T-CHO水平、肠道通透性、血浆LPS水平以及肠道炎症水平（增加TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平,降低IL-10表达水平）的抑制作用被削弱;同时RSV对大鼠结肠CB1和CB2表达的调节作用（升高CB1和降低CB2表达水平）被明显抑制。（3）通过ECS抑制剂/激动剂干预实验发现,RSV可逆转高脂饮食诱导的大鼠结肠CB1活性增加和CB2活性降低,RSV增强肠道屏障完整性及降低肠道通透性的作用可被CB1激动剂ACEA阻断,而RSV抑制肠道炎症的效应可被CB2抑制剂AM630消除。（4）相关性分析发现脱硫弧菌（Desulfovibrio）的丰度分别与血浆LPS浓度,肠道通透性以及结肠CB1的mRNA表达量之间呈正相关。产短链脂肪酸菌LachnospiraceaeUCG010、RuminococcaceaeUCG014、Akkermansia Muciniphila与盲肠内丁酸含量,结肠ZO1、Occludin、CB2的mRNA表达水平之间呈正相关。结论肠道菌群、ECS和SIRT3在高脂饲料诱导的小鼠NAFLD发生发展中起重要作用,高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂肪变性和炎症反应、肠道菌群紊乱和肠道屏障功能下降、CB1表达增加在SIRT3缺失情况下更加显著,提示肠道菌群、ECS可能成为防控NAFLD的重要干预靶点。“肠道菌群-ECS”在白藜芦醇调节肠道屏障功能、改善高脂诱导的大鼠NAFLD发生发展中起关键作用,RSV通过调节肠道菌群稳态减少肠道LPS产生,同时抑制结肠CB1减少肠道通透性及活化CB2减轻肠道炎症,最终减少肠源性LPS导致的肝脏脂肪变性和炎性损伤,延缓NAFLD发生发展。本研究将为预防NAFLD提供新的膳食营养干预策略,并为研究防控NAFLD新型药物研发提供科学依据。