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胶原蛋白酶（collagenolytic protease）是指能降解天然非变性胶原的一类酶。在医学研究中可用于治疗椎间盘突出症等，实验室研究中作为工具酶应用于细胞和器官的分离，基础研究中可应用于胶原结构的研究，工业开发中可应用于胶原分级降解以获得胶原多肽，具有重要的理论研究意义和应用研究价值。微生物和动物组织来源的胶原蛋白酶已经有广泛的研究，至少从不同细菌和真菌中获得40余种胶原蛋白酶，但由于它们大多来源于致病菌株，目前能够商业化生产的胶原蛋白酶的菌株很少。 本实验从成都皮革厂等经常堆积废弃毛皮、皮革的场所采集土样，通过富集、初筛、牛皮消化试验和胶原蛋白酶活性测定等方法，获得12株具有胶原蛋白酶活性的菌株。通过形态观察、生理生化特征分析及BIOLOG微生物鉴定仪鉴定，分别鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudumonas aeraginosa）和火神发光杆菌（Photobacterium logei）。 对铜绿假单胞菌MBL13产胶原蛋白酶发酵条件的研究表明，其产胶原蛋白酶最佳培养基为明胶1％、蔗糖4％、酵母粉0.15％、CaCl20.02％、K2HPO4·3H2O0.25％、NaH2PO4·2H2O0.05％，起始pH6.0。火神发光杆菌MBL59产生胶原四川大学博士学位论文蛋白酶发酵培养基的研究表明，多种氮源、碳源和金属离子能强烈抑制胶原蛋白酶的产生，其产胶原蛋白酶最佳培养基为普通肉汤培养基（牛肉青0.5%:NaCI0.5%;蛋白膝l%）。 按照上述发酵条件获得铜绿假单胞菌MBL13发酵液，通过离心除菌，硫酸钱分级沉淀，sp一sepharose Fast Flow阳离子交换层析，sephi址砂IG一200凝胶过滤层析和活性胶切割等步骤，纯化了铜绿假单胞菌胶原蛋白酶（PAC）.与纯化前的粗酶液相比，酶的比活力提高了36.1倍，达到5.77U/mg，但回收率仅为0.95%。 SDs一PAGE非还原电泳表明该胶原蛋白酶的分子量约为1 1 okD，加入p一疏荃乙醉的还原性电泳表明该胶原蛋白酶并非是单链蛋白质，而是分解为分子量分别为33、25和20kD的3种不同大小的亚基，命名为SubA，SubB和subC。根据分子量大小计算，该胶原蛋白酶是由SubA，SubB和SubC三种不同亚基以2:卜1的比例构成。 酶学性质测定表明该酶最适pH为7.5，最适反应温度为37℃.EDTA和EGTA能够完全抑制胶原蛋白酶PAC的酶活，PMSF、LeupePtin以及PePstainA不能抑制胶原蛋白酶酶活，表明该胶原蛋白酶为一种金属蛋白酶。 测定了纯化的队C SubA亚基N一末端的氨基酸序列，其结果为:川a-Glu一Ala-Gly一Gly一pro一Gly一Gly一Asn一Gln一Lys一Ile曰Gly一Lys一介r。同源性分析发现，该序列与来自铜绿假单胞PA01菌株的弹性蛋白酶的N-末端氨基酸序列完全一致。 已经报道的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶是一种单体蛋白质，没有胶原蛋白酶活性.性质分析表明PAC不同于弹性蛋白酶，也不同于已经发现的其他铜绿假单胞菌菌株来源的胶原蛋白酶，因此PAC是一种新的胶原蛋白酶。 通过离心除菌，硫酸按分级沉淀，DEAE·s叩he Fast Flow阴离子交换层析，疏水层析和SePhadexG一50凝胶过滤层析等纯化步骤获得火神发光杆菌MBL59胶原蛋白酶PLC。与纯化前的粗酶液相比，酶的比活力提高了15.7倍，达到2.2U/mg，回收率为1 .1%。 SDS一PAGE分析表明PLC为单链蛋白质，分子t为35kD。该酶最适反应温度为37℃，最适反应pH为8.5。EDTA和EGTA可以抑制该酶活性，而PMSF、四川大学博士学位论文Leupep血和PePstainA没有彭响，表明PLC也是一种金属蛋白酶。 文献检索未见火神发光杆菌胶原蛋白酶研究的报道，因此，PLc是一种新的胶原蛋白酶。 根据胶原蛋白酶PAC一SubA亚基N末端测序结果和同源性分析，设计了PCR引物扩增出并克隆到SubA亚基的全基因。测序结果显示，该片段全长201 lbp，编码区全长1494bP，该片段是一个完整的基因，命名为pacA基因。该基因编码的蛋白质序列包含有23个氨基酸残基组成的信号肤和174个残基组成的前肤序列。同源性分析表明，该基因序列与己经报道的铜绿假单胞菌PA01菌株弹性蛋白酶lasB基因序列同源性99%，推导成熟肤氨基酸序列完全相同。 将含有pacA全基因的重组质粒转化大肠杆菌EscherichiacoIl’ BLZI（D E3），其转化子细胞经超声波破碎后，其上清液在明胶平板上可产生透明的水解圈;明胶SDS一PAGE显示出与预期大小一致的活性带;SDS一PAGE电泳不能检测到特异表达的蛋白质带，表明该基因表达量低;胶原蛋白酶活性测定显示，表达的SubA没有胶原蛋白酶活性。关键词:胶原:铜绿假单胞菌;火神发光杆菌;胶原蛋白酶:菌株筛选;发酵条件;纯化;基因克隆;基因表达洛分