研究背景及目的:既往研究表明,血管内皮损伤是动脉粥样硬化(AS)形成的起始因素,其修复有利于延缓AS的进展,因此,如何有效地修复受损的血管内皮便成了 AS防治研究的焦点。内皮祖细胞(EPCs)具有分化为内皮细胞(ECs),促进血管形成的能力,因此已经受到人们的广泛关注。近年来的研究发现虽然输注EPCs到动物体内可以有效延缓AS进程,但仍然存在着输注到体内的细胞生存能力低下的问题。AS进程受多种因素影响,其中大多数因素能够诱导氧化应激,而它又直接或者间接促进ECs及内皮受损,触发AS的发生且贯穿整个AS过程。另外有文献报道称氧化应激能够导致EPCs增殖、分化、迁移及粘附等能力的降低,促进细胞凋亡,因此提高EPCs在氧化应激条件下的生存能力则可能为细胞疗法治疗AS提供一种保障。钙库操纵型钙内流(SOCE)是哺乳动物细胞尤其非兴奋细胞是普遍存在的一种Ca2+内流方式。SOCE由钙库操纵型Ca2+通道(SOCC)介导且在多种疾病的病理生理过程中发挥重要作用。本实验室前期研究发现EPCs上存在SOCE,改变SOCC的主要组成蛋白能够影响细胞的增殖、分化、迁移及粘附等功能。但是SOCE是否参与氧化应激诱导的EPCs损伤尚未见报道,另外越来越多的证据表明胞内Ca2+浓度和Ca2+信号通路与氧化应激密切相关。因此,本研究拟利用过氧化氢(H202)作为氧化应激的诱导剂处理EPCs,探索SOCE在氧化应激诱导的EPCs损伤中可能发挥的作用以及相关机制,并尝试寻找减缓甚至逆转氧化应激诱导EPCs损伤的靶点及策略。方法:1. H2O2对EPCs细胞活性、细胞凋亡的影响1.1 EPCs的分离接种、培养及鉴定取雄性SD大鼠,150-180 g,腹腔注射过量的戊巴比妥钠(100 μg/kg)处死,经碘伏消毒后解剖取脾脏,接着梯度离心法分离获取单个核细胞并接种至低糖型培养基中。以培养内皮细胞的条件培养至7天,培养过程中用显微镜观察细胞贴壁情况及细胞形态变化,符合EPCs特征并用DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I荧光双吞法检测细胞是否具备EC特性。1.2 H2O2对细胞活性的影响EPCs培养7天,用胰蛋白酶消化后接种至96孔板,待细胞贴壁后H202处理,cck8检测细胞活性。1.3 H2O2对细胞凋亡的影响EPCs培养7天,H2O2处理细胞,凋亡相关试剂染色后上流式细胞仪检测EPCs凋亡情况。2. H2O2对胞内Ca2+流、SOCE及SOCC复合体的影响2.1 H2O2对胞内钙流的影响2.1.1 EPCs培养7天,避光孵育Fluo-3AM,H202处理后观察细胞内钙流变化。2.1.2 EPCs培养7天,Ca2+螯合剂(BAPTA)预处理,H2O2处理后cck-8及凋亡试剂盒分别检测细胞活性和细胞凋亡情况。2.2 H2O2对SOCE的影响EPCs培养7天,为了探讨H2O2诱导的胞内Ca2+浓度变化是否由SOCE引起的,避光孵育Fluo-3AM,观察无细胞外Ca2+存在情况下,H202和毒胡萝卜素(TG)处理,激光共聚焦显微镜下观察此时及Ca2+浓度回落后加入CaCl2溶液细胞内钙流变化。2.3 H2O2对SOCC复合体的影响2.3.1 EPCs培养7天,提取总RNA,半定量PCR观察SOCC复合体主要组成成分(Orai1、Stim1、Trpc1)转录水平的变化。2.3.2 EPCs培养7天,提取总蛋白,BCA法测量蛋白浓度,Western blot检测翻译水平SOCC复合体主要组成蛋白(Orai1、Stim1、Trpc1)的改变。2.4抑制SOCE后观察H202对胞内钙浓度的影响2.4.1 shRNA干扰Stim1的表达EPCs培养5天,贴壁好,融合度大约30-50%,用携带shRNA的慢病毒转染2天,荧光显微镜观察并用免疫印迹法分析干扰效度。2.4.2抑制SOCE对H202诱导的钙内流的影响药物抑制及shRNA干扰EPCs后,孵育装载Fluo-3AM, HBSS溶液洗去培养液中残留的Fluo-3AM, H202处理并在显微镜下观察Ca2+实时变化情况。3. H2O2增强SOCE对细胞活性及凋亡的影响SOCE抑制剂抑制及shStim1干扰EPCs来抑制SOCE, H2O2处理细胞后分别用cck-8和凋亡试剂盒检测细胞活性及凋亡情况。4. H2O2通过SOCE引起细胞凋亡机制的探讨4.1抑制SOCE对胞内活性氧(ROS)水平的影响培养EPCs,ML-9预处理或shRNA干扰抑制SOCE后加H2O2处理6小时,对比观察细胞凋亡情况。4.2抑制SOCE对caspase家族的影响培养EPCs 7天,H2O2处理并用免疫印迹法分析其对caspase家族蛋白的表达情况的影响,针对有明显变化的caspase家族蛋白,抑制SOCE后观察H202处理对蛋白表达的影响。4.3抑制SOCE对内质网应激水平及线粒体损伤水平的影响观察发现H2O2处理EPCs能够显著上调caspase9和caspase12蛋白的表达水平,这说明H2O2处理可能触发了与内质网应激及线粒体功能紊乱相关的凋亡途径,为了进一步证实这一推论,用H202处理EPCs,免疫印迹法检测内质网应激特异性表达蛋白CHOP、BIP及线粒体功能紊乱标志蛋白cytochrome C的表达变化,并观察线粒体膜电位变化情况。以及抑制SOCE后加H202处理同样检测这些指标,观察其对内质网应激水平及线粒体损伤水平的影响。结果:1. H2O2对EPCs细胞活性、细胞凋亡的影响1.1 EPCs的分离接种、培养及鉴定分离获取脾源性EPCs并接种至低糖型培养基上,期间在倒置显微镜下观察发现贴壁细胞逐渐增大变变圆,最终呈现梭状、纺锤状、树突状等各种形状。荧光双吞法鉴定显示,DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性的细胞大概有85%,这些即为EPCs。1.2 H202对细胞活性的影响不同浓度H202处理EPCs 6小时,cck-8检测细胞活性显示200μM H2O2时细胞活性显著降低(p<0.05),600μM时细胞活性接近50%。用600μM H202处理不同时间发现1小时后细胞活性明显降低(p<0.05),6小时时细胞活性降至50%左右。因此600μM H2O2处理6小时作为后续实验的实验条件。1.3 H2O2对细胞凋亡的影响600μM H2O2处理EPCs 6小时,凋亡试剂盒检测细胞凋亡显示,细胞凋亡明显增加(p<0.05),而且对照组和H2O2处理组细胞凋亡率分别为5.30%和40.65%。2. H2O2对胞内Ca2+流、SOCE及SOCC复合体的影响2.1 H2O2对胞内钙流的影响2.1.1EPCs培养7天,避光孵育Fluo-3AM,600μM H2O2处理并在激光共聚焦显微镜下观察,结果发现,加入H2O2后胞内Ca2+浓度迅速升高。2.1.2为了进一步探讨H2O2、Ca2+浓度与细胞活性及凋亡的关系,首先利用胞内Ca2+螯合剂(BAPTA)预处理EPCs,再用600μM H2O2处理6小时,cck-8检测发现可以显著减缓H2O2造成的EPCs活性的降低(p<0.05),与此同时,流式细胞仪检测结果表明H2O2造成的EPCs凋亡增加的状况也得到显著改善(p<0.05)。2.2 H2O2对SOCE的影响为了探讨H2O2是否通过SOCE诱导胞内Ca2+的改变,避光孵育Fluo-3AM后,HBSS溶液洗脱细胞外Ca2+,H2O2和TG处理EPCs发现H2O2处理与TG 一样能够诱导典型的钙释放激活钙内流的过程。2.3 H2O2对SOCC复合体的影响实验表明H2O2处理能够引起SOCE的变化,为了进一步探讨H2O2引起SOCE改变的机制,我们分别在转录水平及翻译水平检测SOCC复合体组成成分(Orail、Stim1、Trpc1)的改变,结果显示与对照组相比转录水平Orail下调、Stim1上调、Trpc1下调,翻译水平 Orail下调 39.77% (p<0.05)、Stim1 上调 122.03% (p<0.05)、Trpc1 无明显变化(p>0.05)。2.4抑制SOCE后观察H2O2对胞内钙浓度的影响2.4.1针对H2O2引起改变的SOCC复合体主要组成成分,选取干扰Stim1来特异性抑制SOCE,荧光显微镜下观察近一半细胞携带荧光,免疫印迹法结果表明ShRNA干扰能够下调Stim1蛋白表达达30.15% (p<0.05)。2.4.2 SOCE抑制剂(ML-9)预处理及ShRNA干扰Stim1后,600μM H2O2处理6小时观察EPCs胞内Ca2+浓度变化,结果显示抑制SOCE能够明显降低H2O2诱导的胞内Ca2+浓度升高。3. H2O2增强SOCE对细胞活性及凋亡的影响抑制SOCE后600 μ M H2O2处理6小时cck-8检测细胞活性及凋亡试剂盒检测凋亡发现,与H2O2组相比ML-9组和ShRNA干扰组细胞活性分别升高20.04% (p<0.05)和27.68% (p<0.05),细胞凋亡分别降低 16.45% (p<0.05)和 23.34% (p<0.05)。4.H2O2通过SOCE引起细胞凋亡机制的探讨4.1抑制SOCE对胞内ROS水平的影响600μMH2O2处理6小时,胞内ROS水平明显升高(p<0.05),而用胞内ROS清除剂预处理组则细胞凋亡减少18.549% (p<0.05),说明ROS水平的升高会导致细胞凋亡增加,那么抑制SOCE所减缓的H2O2诱导的细胞凋亡是否跟胞内ROS水平相关呢?进一步我们抑制SOCE发现抑制SOCE可以明显降低H2O2诱导的胞内ROS水平的升高(p<0.05)。4.2抑制SOCE对caspase家族的影响为了探索H2O2通过SOCE诱导细胞凋亡的机制,首先检测H202对caspase家族的影响,结果显示它可以明显促进caspase家族成员9和12表达的上调(p<0.05)。4.3抑制SOCE对内质网应激水平及线粒体损伤水平的影响600 μM H2O2处理6小时,能够明显上调caspase家族成员9和12的蛋白表达水平,说明H202处理可能激活了内质网应激凋亡途径和线粒体损伤凋亡途径,为了进一步证实这一推论,我们检测内质网应激及线粒体损伤相关指标,结果显示H2O2明显上调CHOP、BIP及cytochrome C的表达(p<0.05),降低线粒体膜电位(p<0.05),说明H2O2上调内质网应激水平及线粒体损伤水平。而抑制SOCE可以明显降低H2O2诱导的内质网应激水平及线粒体损伤水平的升高(p<0.05)。结论:1. H2O2促进EPCs细胞活性的降低及细胞凋亡的增加。2. H2O2促进EPCs上SOCE的增强。3. H2O2部分通过上调Stim1的表达增强SOCE。4. H2O2通过增强SOCE促进EPCs细胞活性的降低及细胞凋亡的增加。5. H2O2通过增强SOCE激活了内质网应激凋亡途径及线粒体损伤凋亡途径。6.抑制SOCE明显改善氧化应激诱导的EPCs细胞活性降低及凋亡增加的状况,因此,SOCE可能成为提高EPCs在氧化应激条件下生存能力和预防及治疗AS的有效靶点。