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研究目的血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是一种特殊的血液供应模式,具有VM的肿瘤多表现为恶性生物学行为且临床预后差,上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)与肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)理论被认为可能参与了 VM的发生,而EMT及CSC的调控机制中均涉及到Wnt通路,作为Wnt通路的重要分子——DKK1,其与十大恶性肿瘤之首的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中VM的关系尚未见报道,本研究拟探讨DKK1在非小细胞肺癌VM形成中的作用及其相关的分子机制。研究方法1、收集205例人非小细胞肺癌病例,运用HE染色及CD31/PAS双重染色方法检测非小细胞肺癌组织中VM的情况,初步分析其与临床病理参数之间的关系。2、免疫组化方法检测非小细胞肺癌组织中DKK1的表达情况,初步分析其与临床病理参数及VM之间的关系。3、免疫组化方法检测 β-catenin、EMT 相关蛋白(E-cadherin、vimentin、Twist、Slug)、CSC 相关蛋白(EpCAM、CD34、CD44、nestin)、VM 相关蛋白(VE-cadherin、MMP2、MMP9)及 CD34 标记的微血管密度(microvessel density,MVD),初步分析这些蛋白与VM及DKK1的相关性。4、筛选出高表达DKK1及低表达DKK1的NSCLC细胞系,运用质粒转染方法筛选出稳定过表达DKK1的H460细胞和稳定降表达DKK1的A549细胞,观察细胞形态的变化,western blot验证DKK1转染效果并检测EMT相关蛋白、CSC相关蛋白、VM相关蛋白及β-catenin的表达,免疫荧光检测EMT标记蛋白及β-catenin的表达情况。5、运用MTT、划痕实验、侵袭实验及三维培养实验检测DKK1对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭及管道形成能力的影响。6、运用裸鼠移植瘤模型,将稳定过表达DKK1的H460细胞和稳定降表达DKK1的A549细胞接种到裸鼠体内,观察DKK1对NSCLC细胞成瘤能力的影响,并运用免疫组化及endomucin/PAS双染技术检测移植瘤组织中DKK1、β-catenin、EMT相关蛋白、CSC相关蛋白、VM相关蛋白的表达情况及VM的形成情况,进一步明确DKK1对非小细胞肺癌中VM形成的影响。研究结果1、人NSCLC组织中存在VM,存在VM的肿瘤组织分化较差、分期高、易发生转移且预后差(P<0.05);VM与β-catenin、EMT相关蛋白(vimentin、Twist、Slug)、CSC 相关蛋白(CD34、CD44、nestin)、VM 相关蛋白(VE-cadherin、MMP2、MMP9)及 CD34-MVD 呈正相关,与 E-cadherin 呈负相关(P<0.05);而与EpCAM无统计学相关(P>0.05)。2、人NSCLC组织中DKK1呈高表达,DKK1阳性表达的肿瘤组织分化较低且预后差(P<0.05);且且 DKK1阳性表达的组织VM发生率高(P<0.05);DKK1阳性表达与 β-catenin、EMT 相关蛋白(vimentin、Twist、Slug)、CSC 相关蛋白(CD44、nestin)、VM 相关蛋白(VE-cadherin、MMP2、MMP9)及CD34-MVD 呈正相关,与E-cadherin 呈负相关(P<0.05),而与 EpCAM 及CD34无统计学相关(P>0.05)。3、DKK1过表达增强H460细胞的增殖、迁移、侵袭及管道形成能力(P<0.05);DKK1降表达抑制A549细胞的增殖、迁移、侵袭及管道形成能力(P<0.05)。4、H460-DKK1 细胞中 DKK1 表达增高,β-catenin、EMT 相关蛋白(vimentin、Twist、Slug)、CSC 相关蛋白甶(CD44、nestin)及 VM 相关蛋白(VE-cadherin、MMP2、MMP9)表达均增高,E-cadherin 表达降低(P<0.05);A549-shDKK1细胞中 DKK1 表达降低,β-catenin、EMT 相关蛋白(vimentin、Twist、Slug)、CSC 相关蛋白(CD44、nestin)及 VM 相关蛋白(VE-cadherin、MMP2、MMP9)表达均降低,E-cadherin表达升高(P<0.05)。5、H460-DKK1移植瘤生长速度快、肿瘤体积大,肿瘤组织中DKK1、β-catenin、EMT 相关蛋白(vimentin、Twist、Slug)、CSC 相关蛋白(CD44、nestin)及VM 相关蛋白(VE-cadherin、MMP2、MMP9)表达均增高,E-cadherin 表达降低,LPPCN和VM现象增多(P<0.05);A549-shDKK1移植瘤生长慢、体积小,肿瘤组织中DKK1、β-catenin、EMT相关蛋白(vimentin、Twist、Slug)、CSC 相关蛋白(CD44、nestin)及 VM 相关蛋白(VE-cadherin、MMP2、MMP9)表达均减弱,E-cadherin表达增强,LPPCN和VM现象减少(P<0.05)。结论1、人非小细胞肺癌组织中存在VM这种特殊的微循环模式,VM的存在与肿瘤的恶性生物学行为有关,且提示患者预后不良。2、非小细胞肺癌中DKK1呈高表达,其在非小细胞肺癌VM的发生中发挥重要作用。3、DKK1通过促进NSCLC细胞发生EMT、获得CSC特性,促进肺癌细胞增殖、迁移、侵袭并促进VM的形成。