目的:2型糖尿病作为一种常见的慢性代谢疾病,增加骨折风险,干扰骨组织愈合,尤其影响骨形成代谢活动。骨髓间充质干细胞是成骨代谢过程中的重要细胞,在骨再生医学组织工程中可作为种子细胞,具有一定应用前景。先前的研究已证实节律基因与2型糖尿病互相影响,且节律基因参与细胞广泛的生理活动调控。因此,本实验研究通过建立2型糖尿病大鼠模型,探究其骨髓间充质干细胞的成骨分化能力和节律基因表达变化,并探究2型糖尿病微环境中节律基因Clock影响骨髓间充质干细胞成骨分化的调控机制,为防治2型糖尿病引起的骨损伤提供依据。方法:(1)利用GK大鼠,建立并筛选2型糖尿病大鼠模型,以Wistar大鼠作为对照组。分离下颌骨并提取骨髓间充质干细胞,体外纯化、培养糖尿病组和对照组的骨髓间充质干细胞,并应用Micro-CT进行两组下颌骨骨形态计量的扫描分析。(2)通过克隆形成实验、流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡实验、CCK-8实验评价两组细胞的增殖与凋亡活性。两组细胞在成骨诱导7天后进行碱性磷酸酶染色,在成骨诱导21天后进行茜素红染色。利用qRT-PCR、Western blot检测两组细胞成骨诱导前后的节律基因Clock、促炎因子与凋亡因子标志基因、成骨相关基因及NF-κB经典信号通路标志基因表达水平的变化。利用双荧光素酶实验检测两组细胞在成骨诱导前后的NF-κB经典信号通路活性变化。(3)构建慢病毒载体,包装节律基因Clock过表达慢病毒,转染GK糖尿病组骨髓间充质干细胞。利用qRT-PCR检测GK节律基因过表达组、GK空白荧光蛋白过表达组、未转染GK糖尿病组和未转染Wistar对照组细胞的节律基因Clock、成骨相关基因及NF-κB经典信号通路标志基因表达水平的变化。利用双荧光素酶实验检测各组细胞在成骨诱导前后的NF-κB经典信号通路活性变化。结果:(1)2型糖尿病GK大鼠组表现显著较高的空腹血糖值、空腹胰岛素值和葡萄糖耐量值,以及显著较低的体重值。GK糖尿病组下颌骨的骨形态计量分析参数包括骨矿物质密度、骨小梁厚度、骨小梁间距和骨体积分数,与Wistar对照组下颌骨无明显差异,表明短期内2型糖尿病微环境中下颌骨未发生骨质疏松样改变。(2)GK糖尿病组骨髓间充质干细胞的克隆形成单位数目、S期和G2期细胞百分数、CCK-8吸光度值均显著低于对照组,而G1期细胞百分数、早期凋亡率和晚期凋亡率均显著高于对照组,表明2型糖尿病微环境促进骨髓间充质干细胞的凋亡活性并抑制其增殖活性;糖尿病组骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色和茜素红染色较对照组浅且稀疏,同时成骨相关标志基因包括OPN、Runx2、OSX、ALP的表达水平较对照组低,表明2型糖尿病微环境抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;糖尿病组骨髓间充质干细胞的节律基因Clock,促炎因子包括IL-lβ、TNF-α、IL-6,凋亡标志基因caspase-3、caspase-8,以及NF-κB经典信号通路标志基因p65、p-IKKα的表达水平在成骨分化诱导前后较对照组显著增高。同时双荧光素酶试验表明成骨分化诱导前后糖尿病组骨髓间充质干细胞的NF-κB经典信号通路活性显著高于对照组。(3)GK节律基因过表达组骨髓间充质干细胞节律基因Clock的表达水平显著高于其余三组。同时GK节律基因过表达组细胞的NF-κB经典信号通路标志物基因p65、p-IKKα的表达水平较其余三组显著增高,且GK节律基因过表达组细胞的成骨相关标志基因Runx2、ALP较其余三组显著降低。双荧光素酶试验表明GK节律基因过表达组骨髓间充质干细胞的NF-κB经典信号通路活性显著高于其余三组。结论:(1)短期内2型糖尿病微环境下的下颌骨未发生骨质疏松样改变。(2)2型糖尿病微环境下骨髓间充质干细胞增殖活性和成骨分化能力降低。(3)2型糖尿病微环境下骨髓间充质干细胞的节律基因Clock表达增加,上调NF-κB经典信号通路活性,参与抑制细胞成骨分化活性。(4)节律基因Clock可能成为骨再生医学组织工程中的调控靶点。