论文部分内容阅读
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium,S.Typhimurium）是一种重要的食源性病原菌,是公认的人畜共患病致病菌,严重威胁畜禽养殖业和人类公共卫生安全。目前,它在畜禽养殖业中的防治措施仍存在一定缺陷,导致大量畜禽及其副产品的污染时有发生,因此,开发新型有效的预防和治疗药物具有重要意义。丁香酚因其抗菌、抗炎、抗氧化的特性而备受关注,但其对鼠伤寒沙门氏菌致病能力与宿主反应的研究明显不足。本研究首先考察了丁香酚对鼠伤寒沙门氏菌的抗菌活性,然后建立SL1344体内、外感染模型,以其致病特性和主要毒力因子为切入点,通过分析Ⅲ型分泌系统和Ⅰ型菌毛相关毒力基因的mRNA转录水平,对宿主细胞的粘附、侵袭和胞内增殖的能力;感染宿主引起的炎症信号通路主要蛋白磷酸化激活和炎症因子表达水平,肠道紧密连接关键蛋白表达以及肠道菌群变化等情况,探讨了丁香酚抑制鼠伤寒沙门氏菌致病能力的潜在机制,为其抗菌作用的相关研究和临床应用提供参考和理论依据。1 丁香酚对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性及致病性研究该研究主要通过检测丁香酚对鼠伤寒沙门氏菌（SL1344）的抑菌浓度、时间杀伤曲线、AKP活性、胞内核酸含量和超微结构的影响,来确定其体外抑菌活性;通过检测丁香酚对SL1344的Ⅲ型分泌系统和Ⅰ型菌毛相关毒力因子的表达,并利用丁香酚体外预处理的SL1344感染雏鸡,来评估丁香酚对其致病性的影响。结果表明,丁香酚对SL1344和临床分离耐药株均具有明显的抑制活性,MIC 和 MBC 的范围分别为 0.0625-0.25 mg/mL 和 0.125-0.5 mg/mL;丁香酚处理引起细菌培养液中AKP活性和OD260显著升高;菌毛受损、菌膜模糊,菌体超微结构明显皱缩变形。qRT-PCR结果显示,丁香酚可明显抑制Ⅰ型菌毛相关黏附因子（fimA、fimH、fimD、fimY、fimZ、stm0551）和Ⅲ型分泌系统相关毒力因子（hilA、hilD、sipA、sipC、spiC、misL）mRNA的表达。SL1344经口感染会引起雏鸡发病甚至死亡、增重下降、脏器载菌量显著增加,十二指肠明显的炎性病变伴随炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-18的表达水平升高;而经1/2 MIC（0.0625 mg/mL）丁香酚体外预处理的SL1344,感染雏鸡后的上述指标均明显减轻。以上结果表明,亚抑菌浓度的丁香酚可破坏细菌菌毛、菌膜等形态结构,并降低Ⅲ型分泌系统和Ⅰ型菌毛相关毒力因子的表达而抑制菌体活力并减弱其对雏鸡的致病力。2 丁香酚抑制鼠伤寒沙门氏菌对细胞的粘附和侵袭通过建立SL1344感染IEC-6、RAW264.7和DF-1细胞的体外模型,来评估丁香酚对鼠伤寒沙门氏菌粘附、侵袭宿主细胞及细胞内增殖的影响。首先,我们利用CCK-8检测了丁香酚对上述三种细胞活性的影响,明确了不影响细胞活性的浓度范围是≤383μM。然后选择96 μM和192 μM丁香酚处理细胞与SL1344的共培养系统,检测丁香酚抑制SL1344对细胞粘附、侵袭和胞内增殖情况。结果显示,96 μM和192 μM丁香酚可不同程度地抑制SL1344对细胞的粘附与侵袭;其中,对SL1344粘附IEC-6、RAW264.7和DF-1细胞的抑制率分别为31%和50%、30%和49%、19%和31%;对侵袭细胞的抑制率分别为11%和25%、25%和35%、18%和30%;对胞内增殖的抑制率分别为36%和76%,28%和75%,44%和78%。这提示96μM和192 μM丁香酚可以抑制鼠伤寒沙门氏菌对宿主细胞的粘附、侵袭和胞内增殖的能力。3 丁香酚对鼠伤寒沙门氏菌感染雏鸡具有预防保护作用为了评估丁香酚的体内抗感染活性,我们首先考察了丁香酚对雏鸡的安全性,发现其LD50为251.18 mg/kg,95%置信区间是250.61-251.75 mg/kg;然后利用7 d毒性实验确定其安全浓度范围为≤64.07mg/kg体重。接下来,通过雏鸡口服接种SL1344制备感染模型,研究不同剂量（25、37.5和50mg/kg体重）丁香酚的防护作用。雏鸡11日龄时开始连续7d 口服丁香酚,13日龄时口服接种SL1344（5×108 CFU/mL）1 mL/只,连续3d,18日龄试验结束并采样;记录病雏的临床表现,并检测盲肠和十二指肠的组织病理学和超微结构变化、NF-κB和紧密连接关键蛋白表达及炎症因子mRNA转录水平。结果表明,雏鸡感染SL1344感染会引起发病死亡,相对增重明显下降,并对十二指肠和盲肠造成组织损伤和超微结构的破坏;但提前口服50mg/kg体重的丁香酚,可明显减轻SL1344感染引起的临床症状和各种组织病变。进一步研究发现,丁香酚抑制十二指肠和盲肠的TLR4、MyD88和iNOS的mRNA水平,降低NF-κB信号通路关键蛋白p65和IκBα的磷酸化水平,并相应减少了炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-18的mRNA表达量,还维护了病雏肠道紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1、occludin的表达。以上结果表明,丁香酚对SL1344感染雏鸡具有明显的预防保护作用。4 丁香酚对鼠伤寒沙门氏菌感染雏鸡肠道菌群的影响口服丁香酚可减轻SL1344感染雏鸡的肠道炎症和肠屏障损伤,推测该作用与其减少肠道内SL1344定殖和调节肠道菌群有关。为此,我们检测了各组雏鸡盲肠内容物中沙门氏菌的数量,结果显示,丁香酚预处理可以减少盲肠内容物中沙门氏菌数量。利用16S rDNA高通量测序技术对盲肠内菌群进行分析,结果显示,相较于空白组,SL1344感染组盲肠内的Chao1指数、Shannon指数和物种丰度显著上升,提示盲肠内出现菌群过度生长的情况;丁香酚预处理后Chao1指数、Shannon指数和物种丰度表现出下降趋势。通过Beta多样性指数和PCoA主坐标轴分析发现,SL1344感染组盲肠内菌群多样性增加,在PC1水平上,空白组远离SL1344感染组;在PC2水平上,随着丁香酚浓度的增加而逐渐偏离SL1344感染组。盲肠内菌群物种丰度的分析发现,与空白组相比,SL1344感染组盲肠内肠杆菌科显著增多,厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度减少;而50mg/kg丁香酚可明显提高厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度,并使肠杆菌科明显减少。因此,口服丁香酚可抑制肠道内沙门氏菌的定殖和肠杆菌科的过度增殖,从而维持了肠道菌群平衡。综上所述,丁香酚暴露可改变SL1344的菌体形态结构和质膜通透性而发挥直接抗菌活性;还可通过降低Ⅰ型菌毛相关粘附基因和Ⅲ型分泌系统毒力因子的表达水平,减弱它对宿主细胞的粘附、侵袭和胞内增殖能力而降低对雏鸡的致病力。口服丁香酚可以抑制沙门氏菌在肠道内的定殖,减少肠杆菌科过度增殖并维持厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度,维护肠道菌群稳定性的同时,还抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活和炎症反应,维持了肠道紧密连接蛋白的表达,从而对鼠伤寒沙门氏菌感染起到保护作用。