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第一部分 RASSF6在人乳腺癌中的甲基化检测及功能机制研究 目的： 1检测RAS相关结构域家族成员6(Ras association(RalGDS/AF-6) domain family member6,RASSF6)在人乳腺癌细胞株中及乳腺癌组织中的表达情况； 2检测RASSF6启动子CpG岛在人乳腺癌细胞株和人乳腺癌组织中甲基化情况； 3验证RASSF6对人乳腺癌细胞增殖，细胞周期，细胞凋亡，细胞迁移侵袭方面的调控作用； 4探讨介导RASSF6抑癌作用相关的信号通路改变。 方法： 1采用RT-PCR检测RASSF6在人正常组织、人乳腺癌细胞株和人正常乳腺组织中的表达情况；采用Western blot检测RASSF6在人乳腺癌细胞株中的表达情况；采用Real-time PCR检测RASSF6在人乳腺癌组织和癌旁组织中的表达情况；分析 Oncomine微阵列芯片数据库中，RASSF6在人乳腺癌正常组织及癌组织中的表达情况。 2使用甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）检测 RASSF6在人乳腺癌细胞株和人乳腺癌组织中的启动子甲基化情况；使用BGS检测＃115号乳腺癌样本中RASSF6启动子甲基化情况。 3体外实验中，使用平板克隆实验，软琼脂克隆实验，CCK-8实验， EdU掺入实验检测RASSF6对人乳腺癌细胞增殖能力的调控作用。 4体内实验中，使用裸鼠成瘤实验验证RASSF6对人乳腺癌细胞增殖能力的调控作用。 5采用流式细胞仪检测RASSF6对人乳腺癌细胞的细胞周期的调控作用，并采用Western blot检测RASSF6对p21和p27的调控作用。 6采用AO/EB染色和流式细胞仪检测RASSF6对人乳腺癌细胞凋亡的诱导作用，并用Western blot检测cleaved-caspase3， cleaved-caspase7，cleaved-caspase9，cleaved-PARP的变化。 7采用划痕实验和 Transwell小室检测RASSF6对人乳腺癌细胞迁移能力的调控作用；采用 Transwell小室检测RASSF6对人乳腺癌细胞侵袭能力的调控作用；采用Real-time PCR和Western blot检测RASSF6对S100A4，MMP2的调节作用。 8采用Western blot检测RASSF6对Akt信号通路的调控作用。 结果： 1 RASSF6在人正常组织和人正常乳腺组织中广泛表达；而在人乳腺癌细胞株中，多个细胞表达下调或缺失，包括 BT549和MDA-MB-231等三阴性乳腺癌细胞株；相对于人乳腺癌旁组织， RASSF6在人乳腺癌组织的表达显著下调。 2 RASSF6在 BT549和MDA-MB-231细胞株中检测到甲基化，在人乳腺癌组织中检测到广泛甲基化。 3体外实验中，平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验显示RASSF6可显著抑制人乳腺癌细胞的克隆形成能力；CCK-8实验和EdU掺入实验显示出 RASSF6抑制增殖的能力；体内实验中， RASSF6可显著抑制移植瘤的生长速度。 4流式细胞结果显示RASSF6可显著抑制G0/G1期向S期转换，且显著上调p21；AO/EB染色和流式细胞结果显示RASSF6可诱导人乳腺癌凋亡，且caspase3，caspase7，caspase9，PARP发生剪切。 5划痕实验和 Transwell实验显示RASSF6可显著抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭，且显著下调S100A4和MMP2的表达。 6Western blot结果显示RASSF6可显著下调Akt的磷酸化水平，而Akt为S100A4和MMP2的上游信号通路。 结论： 1 RASSF6由于启动子 DNA甲基化导致其在人乳腺癌组织中的表达显著下调。 2 RASSF6通过抑制Akt信号通路调控人乳腺癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力。 第二部分 miR-7-5p靶向REGγ抑制人乳腺癌细胞增殖 目的： 1验证敲减 miR-7-5p对人乳腺癌细胞增殖的调控作用以及对 REGγ表达的调节作用。 2验证REGγ是否会逆转miR-7-5p抑制人乳腺癌细胞增殖功能。 3体内实验验证miR-7-5p抑制人乳腺癌细胞增殖。 方法： 1使用瞬时转染miR-7-5p抑制剂抑制miR-7-5p的表达，采用CCK-8实验检测细胞增殖能力以及使用Western blot检测REGγ蛋白水平变化；并使用流式细胞仪检测细胞周期改变。 2共转染 miR-7-5p和REGγ，采用CCK-8实验检测细胞增殖能力以及采用流式细胞术检测细胞周期改变。 3使用过表达 RASSF6的细胞株以及对照细胞株构建裸鼠移植瘤模型；测量移植瘤的体积和重量；且使用免疫组化检测Ki-67和REGγ的变化。 4提取 Oncomine微阵列芯片数据验证在同样的乳腺癌组织中miR-7-5p和REGγ之间的相关性。 结果： 1敲减miR-7-5p可促进人乳腺癌细胞的增殖能力，促进G0/G1期向S期转化，且REGγ蛋白水平有显著上调。 2 REGγ可部分逆转miR-7-5p的抑增殖功能，细胞周期结果显示出相同的变化。 3移植瘤构建成功，miR-7-5p可显著抑制移植瘤的生长；移植瘤切片显示增殖相关基因Ki-67显著下调及REGγ蛋白水平显著下调。 结论： 1 miR-7-5p可通过靶向 REGγ抑制人乳腺癌细胞的增殖，REGγ为miR-7-5p下游靶基因。