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目的:2,5’-二溴-4,5,2’-三羟基二苯甲酮(LF1)是课题组正在研制的化学一类新药,本文对工艺优化后的LF1原料药进行有关物质和有机溶剂残留量检查,确定杂质和有机溶剂量限度以全面控制该新药质量;通过晶型检查和质量标准为检测指标的稳定性研究以确定原料药的有效期并为其后续包装、贮藏和运输条件提供科学依据;通过对检测到的有关物质进行细胞毒性测试,为原料药的安全性预测和有关物质检查限度的确定奠定试验基础。方法:(1)通过HPLC对起始物料邻苯二甲醚(LF1-SM01)和邻甲氧基苯甲酰氯(LF1-SM02)、中间体(LF1-01、LF1-02)及生成的原料药(LF1-API)进行有关物质检查。由于酰氯极易与水反应生成酸,LF1-SM02无法直接通过HPLC法进行测定,故首先将其完全甲酯化后转化为邻甲氧基苯甲酯(LF1-SM02-JZ,已通过氢谱确证其结构),通过测定其甲酯化产物LF1-SM02-JZ的含量来检查起始物料LF1-SM02的限度。HPLC色谱条件为Agilent C18色谱柱(4.6×250mm,5μm),流动相A(磷酸水溶液,pH2.0)和流动相B(乙腈)梯度洗脱,柱温30℃,DAD检测器,检测波长230nm,流速1.0ml/min,进样体积10μl。采用HPLC-MS对原料药LF1及其杂质进行结构辅助确证,质谱条件为电喷雾离子源(ESI),正离子MRM模式扫描,电离喷雾电压1000V,椎孔电压100V,雾化气为氮气,雾化气压力为10psi,干燥气温度139℃,干燥气转速1L/h,质谱扫描质量范围(m/z)为100-1000。(2)通过气相色谱法检测LF1原料药合成工艺中使用到的有机溶剂残留量(乙醇、正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃),色谱条件为6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷为固定液的毛细管色谱柱,起始温度为60℃,维持5min,以5℃/min的速率升温至80℃,维持5min,再以30℃/min的速率升温至200℃,维持3min,进样口温度200℃,氢火焰离子检测器,检测器温度250℃,氮气为载气,分流比为10:1,顶空瓶平衡温度为90℃,平衡时间为30min,顶空进样。(3)开展影响因素试验(高湿RH92.5%±5%;高温60℃±2℃;光照4500Lx±500Lx)、加速试验(40℃±2℃;RH75%±5%)和室温长期试验(25℃±2℃;RH60%±5%)等,通过检测其性状、熔点、晶型检查、有关物质检查和含量测定等指标进行原料药的稳定性试验。(4)通过MTT法研究LF1原料药中检查到的杂质2,5’-二溴-4,5,2’-三羟基二苯甲酮(LF1-API-imC)对EA.hy 926血管内皮细胞的细胞毒性。结果:(1)建立了LF1起始物料、中间体和原料药的有关物质检查方法。(1)起始物料LF1-SM01供试品中未检出LF1-SM01-imA,可检出LF1-SM01-imB,检出量在0.1%以下;起始物料LF1-SM02供试品中未检出LF1-SM02-imB,可检出LF1-SM02-imA,该杂质在中间体中继续进行检查。(2)中间体LF1-01供试品中未检出工艺杂质LF1-01-imA和物料残留(LF1-SM01、LF1-SM02-imA、LF1-SM01-imB),但有其他未知单杂被检出,检出量在0.1%以下;中间体LF1-02供试品中未检出工艺杂质LF1-02-imA及物料残留LF1-01,但可检出单溴代副产物LF1-02-imB,检出量在0.5%以下。(3)三批LF1原料药中试样品中未检出工艺杂质(LF1-API-imA和LF1-API-imB)和物料残留LF1-02,可检出LF1-API-imC(LF1-02-imB的完全去甲基化产物),检出量在0.1%之下。原料药LF1及其三个杂质的结构通过与对照品的质谱图比较得到确证。(2)建立了顶空毛细管柱气相色谱法测定LF1原料药中乙醇、正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃等有机溶剂残留量的方法,三批原料药中试样品中均可检出乙醇,乙醇残留量在控制限度0.5%之下,而另外三种溶剂未检出。(3)稳定性实验表明,与0天测定结果相比,影响因素试验(5、10、30天)、加速试验(1、2、3个月)以及室温长期留样试验(3个月)的各项检测指标均未发生显著性变化,X-射线衍射法检测的晶型特征峰的出峰时间和峰强度均无明显差异。(4)细胞毒性实验显示,LF1原料药中所含杂质LF1-API-imC在0.01~0.5μmol/L范围内(按照LF1-API最大给药量10μmol/L的0.1%、0.2%、1.0%、2.0%、5.0%设计)时,细胞存活率均大于98.0%,且各浓度下细胞存活率无显著性变化。结论:LF1原料药有关物质检查法符合方法学验证的各项要求,该方法能够有效检出有关物质;LF1原料药中单杂不过0.1%,总杂不过1.0%。LF1原料药有机溶剂残留量检查法符合方法学验证的各项要求,该方法能够有效检出乙醇、正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃这四种残留溶剂;现工艺生产的LF1原料药的有机溶剂残留量符合要求。LF1原料药的包装材料不需要避光,LF1原料药在40℃/RH75%条件下稳定,其有效期需根据长期试验的后续试验时间和各项检测指标的测定结果而定。目前工艺生产的原料药在拟定临床给药剂量下其有关物质LF1-API-imC对血管内皮细胞EA.hy 926没有细胞毒性。