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宿主可以通过改变病灶部位的金属元素平衡以响应病原菌侵染,包括产生金属螯合蛋白或者富集有毒金属离子攻击入侵的病原菌,这种生理行为被定义为营养免疫。水稻在接种水稻黄单胞菌白叶枯致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo）后,茎部的铜离子浓度显著上升,说明Xoo在侵染水稻时遭遇了宿主铜离子营养免疫。病原菌成功致病需要克服宿主铜离子免疫,然而,铜离子营养免疫的对抗模式研究多集中于动物病原菌,铜离子耐受在植物病原菌感染宿主过程中的作用研究还十分有限。水稻黄单胞菌是研究植物病原细菌与宿主铜离子营养免疫对抗机制的良好模式生物。水稻黄单胞菌白叶枯致病变种是一种革兰氏阴性植物病原菌,可以引发水稻白叶枯病,造成水稻大量减产。本课题组以水稻黄单胞菌白叶枯致病变种PXO99A作为研究对象,前期利用基因敲除技术筛选PXO99A中致病相关潜在功能基因,发现了一个功能未知蛋白的缺失会导致细菌致病力急剧下降,通过基因回补可以恢复突变体对水稻的致病力,在此研究中将该蛋白命名为CtvP（Copper tolerance and virulence related protein）。通过进化分析,发现CtvP蛋白在黄单胞菌属中保守存在。进一步信息学分析发现,CtvP蛋白含有一个铜离子结合结构域NosD（Periplasmic copper-binding protein）。由于CtvP蛋白含NosD结构域,推测该蛋白可能是铜离子耐受相关蛋白。蛋白定位常常与功能紧密相关,通过生物信息学预测CtvP蛋白可能定位在细胞周质空间。首先对CtvP蛋白亚细胞定位进行验证,分离PXO99A亚细胞组分后,通过Western Blot检测带eGFP标签的CtvP融合蛋白表达情况,证实CtvP蛋白定位在细胞周质空间。进一步对CtvP蛋白功能进行验证,在体外添加高浓度铜离子压力下,检测ctvP缺失突变体和野生型菌株生长差异,发现ctvP基因缺失导致水稻黄单胞菌对铜离子的耐受能力下降。为进一步探究CtvP蛋白所介导的铜离子耐受机制,我们研究了CtvP与经典的铜离子耐受相关蛋白的关系。通过细菌双杂交系统筛选,发现CtvP可以与铜离子耐受相关同源蛋白CopA、CopB相互作用。对PXO99A中CopA、CopB蛋白铜离子耐受功能进行验证,发现copA或copB缺失均会导致Xoo铜离子耐受能力显著下降。根据以上结果和生物信息学预测,初步建立了Xoo铜离子耐受模型:周质空间蛋白CtvP与多铜氧化酶CopA和排铜动力蛋白CopB构成铜离子传递链,共同将铜离子泵出胞外,或者将铜离子脱毒固定于周质空间。通过实时荧光定量PCR和GUS酶活检测,发现高浓度铜压力下会诱导ctvP基因表达上调。同样地,在铜离子刺激下copA、copB基因也表达上调。虽然过量的铜离子对细胞具有毒性,然而,适量的铜离子是细胞正常生命活动所必需的。据此,我们推测水稻黄单胞菌的ctvP、copA、copB等铜离子耐受相关基因受到严谨的表达调控。感知和传递胞外信号通常是由双组份信号传导系统介导,已知柑橘溃疡病菌中的双组份信号传导系统ColS/ColR与铜耐受相关。对PXO99A中同源蛋白ColS/ColR进行铜耐受相关功能验证,发现colS缺失突变体铜离子耐受能力显著下降,同时该双组份系统响应铜离子刺激。实时荧光定量PCR结果表明,ctvP受双组份信号传导系统ColS/ColR正调控,CtvP同时有利于colS表达,然而CtvP与ColS之间无蛋白水平的直接相互作用。此外,通过细菌单杂交也未检测到可作为转录因子ColR与ctvP基因启动子相互作用。因此,我们筛选了ColS/ColR下游可能调控ctvP表达的转录调控因子,通过细菌单杂交系统,发现ctvP启动子与金属平衡调控相关转录调控因子Zur存在相互作用。通过高浓度铜生长抑制检测,发现转录调控因子Zur同样参与铜离子抗逆过程。基因表达检测结果表明Zur负调控ctvP表达,同时zur基因受双组份信号传导系统ColS/ColR正调控,然而通过细菌单双杂系统,未检测到Zur与ColS蛋白水平的相互作用,以及ColR与zur基因启动子相互作用。值得注意的是,ctvP缺失突变体内与致病相关的hrp基因表达显著下调。而在铜刺激下,PXO99A中hrp基因表达上调。根据以上结果,我们初步推测了黄单胞菌体内铜离子平衡调控网络:在低浓度铜离子环境下,转录调控因子Zur抑制ctvP表达,此时不需要CtvP与CopAB排铜;当环境铜离子压力增加时,位于周质空间的CtvP蛋白感应周质高浓度铜离子压力,并将信号传递给双组份信号传导系统ColS/ColR,然后ColS/ColR激活转录调控因子zur表达,Zur结合铜离子后解除对ctvP的转录抑制,并激活下游致病相关hrp基因表达,共同促进Xoo克服铜离子营养免疫。综上所述,我们发现CtvP对Xoo致病起关键作用,不仅参与铜离子解毒作用,还作为感应蛋白参与铜离子平衡和毒力调控,在水稻黄单胞菌克服宿主铜离子营养免疫发挥着重要功能。对CtvP蛋白的功能深入研究有助于我们更好的理解植物病原菌是如何克服宿主营养免疫。