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目的:内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是多种肝脏疾病中一种常见病理现象,可被乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)等多种因素所诱导,在前期研究中我们发现肝细胞ERS明显降低细胞外HBV DNA及相关抗原水平,然而ERS对肝细胞内HBV DNA复制及其抗原合成的影响尚不清楚,另外,肝细胞ERS对抗病毒药物的影响尚无研究。本课题旨在初步探讨ERS对HBV复制及恩替卡韦(entecavir,ETV)抗病毒作用的影响。方法:以HBV稳定转染人肝癌细胞株Hep G2.2.15细胞为研究对象,用毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)诱导细胞发生ERS,以建立ERS细胞模型。应用流式细胞术检测TG对细胞凋亡的影响。应用蛋白免疫印迹(western blot,WB)法检测葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、磷酸化真核起始因子2α(phosphorylated eukaryotic initiation factor 2 alpha,p-e IF2α)和内质网甘露糖甙酶-Ⅰ样蛋白(ER degradation-enhancingα-mannosidase-like protein,EDEM);实时荧光定量逆转录聚合酶连反应(real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测肌醇酶1(inositol requiring enzyme-1,IRE1)、活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、GRP78 m RNA判断肝细胞ERS。通过实时荧光聚合酶链反应(real-time fluorescent polymerase chain reaction,PCR)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、q RT-PCR、化学发光微粒子免疫检测法及WB检测细胞培养上清中的HBV DNA、HBs Ag、HBe Ag水平,细胞内的HBV DNA、3.5kb HBV m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag水平,初步探讨TG诱导的ERS对HBV复制的影响。随后用q RT-PCR检测法尼酯X受体(farnesoid X receptor,FXR)、肝细胞核因子1(hepatocyte nuclear factor 1,HNF1)、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)等14种影响HBV复制的转录因子的m RNA水平,初筛出TG诱导的ERS影响HBV复制的转录因子;最后用ETV对TG诱导Hep G2.2.15 ERS进行干预,观察TG诱导的ERS对ETV抗病毒作用的影响。结果:1.流式细胞仪检测细胞凋亡率发现,0.5μM TG作用于Hep G2.2.15细胞24 h、48 h、72 h并未引起明显的细胞凋亡。2.0.5μM TG作用Hep G2.2.15细胞24h、48h、72h后,GRP78、PERKATF6IRE1 m RNA水平显著上调,GRP78、EDEM蛋白水平及e IF2α磷酸化水平显著增加。以上结果证实TG显著诱导Hep G2.2.15细胞发生ERS并激活内质网相关降解途径(ER-associated degradation,ERAD)。3.0.5μM TG作用Hep G2.2.15细胞24、48、72h,细胞培养上清中的HBs Ag、HBe Ag显著降低;细胞内HBV DNA、3.5kb m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag和HBc Ag蛋白水平显著升高。4.0.5μM TG作用Hep G2.2.15细胞48h,诱导细胞ERS,发现促进HBV复制的11种转录因子,只有FXR上调,其余均呈不同程度的下调;抑制HBV复制的转录因子NF-κB显著性下调。5.TG诱导Hep G2.2.15细胞ERS,并用10μM ETV干预4天,观察TG诱导的ERS对ETV抗病毒作用的影响。结果提示,ETV显著下调Hep G2.2.15细胞上清液中的HBV DNA、HBe Ag和HBs Ag及细胞内的HBV DNA、3.5kb m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag、HBc Ag蛋白;经TG诱导Hep G2.2.15细胞ERS后,ETV同样显著下调细胞内外的HBV相关指标;TG处理Hep G2.2.15细胞,经ETV干预后细胞上清液中的HBV DNA、HBe Ag和HBs Ag较未经TG处理的Hep G2.2.15细胞显著降低,然而细胞内的HBV DNA、3.5kb m RNA、HBV-s m RNA及HBs Ag、HBc Ag蛋白却较未经TG处理的Hep G2.2.15细胞显著升高。以上结果表明TG诱导的ERS抬高了HBV复制基线,延长了细胞内HBV清除所需的时间。6.TG诱导Hep G2.2.15细胞ERS,并用10μM ETV干预4天。通过抗病毒治疗后,TG处理的Hep G2.2.15细胞内的GRP78、PERK、ATF6、IRE1 m RNA显著下调,GRP78蛋白表达及e IF2α磷酸化水平也显著下调。结论:1.TG诱导的Hep G2.2.15细胞ERS引起HBV DNA、HBs Ag胞内积累与HBV复制作用加强和HBV DNA、HBs Ag分泌减少有关;2.TG诱导的Hep G2.2.15细胞ERS促进HBV复制,可能与FXR促进作用增强、NF-κB抑制作用减弱有关;3.TG诱导的Hep G2.2.15细胞ERS延长了ETV处理后细胞内HBV清除所需的时间;4.ETV抗病毒作用后可部分缓解细胞ERS。