研究目的肥胖不仅是体重超标,也是一种独立的疾病,同时又是Ⅱ型糖尿病、心血管病、非酒精性脂肪肝、高血压、不孕不育、骨质疏松等代谢性疾病的高危诱发因素。减肥、瘦身和纤体成为当今社会健康保健和临床医学、美容的时髦话题。研究发现瘦素和瘦素受体基因的异常、功能发挥受阻和瘦素抵抗现象与肥胖症、糖尿病、脂肪肝、不孕不育和骨质疏松的发生关系密切。瘦素通过激活位于细胞表面的瘦素受体参与糖、脂肪及能量代谢的调节,促使机体减少摄食、增加能量释放和发挥抑制脂肪沉积的生物学作用。瘦素及瘦素受体功能异常可导致糖、脂肪、激素等代谢的异常。理想的代谢性疾病动物模型是疾病发病机制和防治研究的基础。口前,代谢性动物模型制作方法有很多,如电解法、物理损伤法、化学药物诱导法等是以损伤下丘脑造成过量摄食建立的肥胖症模型,这些方法不仅刺激性太大,而且与人类肥胖的发生过程相距甚远。高脂高糖饮食法是常用的代谢性疾病造模方法,但随着人们健康意识的加强,很多人控制高脂高糖饮食后仍然发生肥胖、II型糖尿病等代谢性疾病,说明高糖高脂饮食法造模存在一定的局限性,提示可能有其他的原因导致代谢紊乱。近年来在畜牧业上利用瘦素或其受体重组融合蛋白免疫法调控畜禽生产育肥、脂肪沉积和增加瘦肉率已取得很好效果,但尚未见该法建立代谢性疾病模型、预防控制代谢性疾病的报道。我们预测该法在代谢疾病(特别是肥胖)模型制作和代谢性疾病防治领域应用将会提供新的思路和途径。本项目利用瘦素或其受体功能片段融合蛋白主动免疫SD大鼠,对脂肪沉积、胰岛功能及调控基因、瘦素信号通路等进行深入研究,不但对以肥胖症为标志相关代谢性疾病(Ⅱ型糖尿病、非酒精性脂肪肝等)的新型动物模型制作和疾病防治新方法进行探索性研究,也为临床代谢性疾病发生、治疗机制研究提供理论和实验依据。实验方法(1)瘦素或瘦素受体蛋白表达、纯化和浓缩确定瘦素或瘦素受体表达菌的准确性后,大量培养瘦素或瘦素受体重组融合蛋白表达菌,收集菌泥,加入Buffer B裂解并超声破碎,使菌充分裂解,收集上清液,即为融合蛋白裂解液。随后,利用带有His-tag的50%Ni-NTA凝胶层析融合蛋白裂解上清,收集层析液。层析液即为纯化的蛋白。将装有纯化蛋白的透析袋放置在透析液复性。最后利用聚乙二醇20000浓缩目的蛋白,-20℃保存用于制备免疫原。(2)免疫原的制备油乳剂免疫原分水相和油相两部分:油相含4%吐温80,2%吐温85,94%10号矿物油,2g硬脂酸铝,并高压灭菌;水相含4%灭菌后的吐温80,96%重组蛋白。其中油相和水相比例(V/V)是2:1。先将含4%(V/N)吐温80的水相加入匀浆机,3,000r/min混合1Omin,将其倒出;再将油相加入匀浆机,然后边搅拌边逐滴加入水相,待水相全部加完后,3,000r/min混合20min,获得的白色的油乳剂即为重组蛋白油乳剂免疫原。按照本实验要求,所制成的油乳剂瘦素(Lep,leptin)或瘦素受体(LepR,leptin receptor)免疫原含重组蛋白的浓度为2mg/mL,对照组为钥孔血蓝蛋白(KLH,keyhole limpet hemocyanin)的免疫原,浓度也为2mg/mL,免疫原于4C保存备用。(3)动物实验方法①动物分组与饲养管理挑选48只体重均匀、健康的40日龄SD大鼠♀,随机分为3组。KLH组15只,LepR组17只,Lep组16只;每单笼饲养,预饲5天后进行正式实验。供试SD大鼠在整个实验期间饲养在屏障设施中,给予灭菌鼠料和灭菌水,自由采食、饮水。②动物免疫计划与免疫剂量实验全期按免疫次数分成3个阶段:以第一次免疫前一天记为第0天,于第1天进行第一次免疫,第21天、42天加强免疫。免疫采用腿肌两侧两点注射方法,实验组每只每次免疫1mg LepR或Lep重组融合蛋白,对照组免疫1mg KLH蛋白。③数据采集血样采集:在实验的第0、7、14、21、28、35、42、49、52天,在麻醉(盐酸赛拉嗪,0.13 mg/kg)状态下,对大鼠进行眼眶静脉丛采血,每只大鼠采血1～2mL,分离血清用于性激素、代谢相关激素、血生化检测等。24小时采食量、体重、体长测定和Lee’s指数(大鼠肥胖指数)计算:分别在实验的第0、7、14、21、28、35、42、49、52天对大鼠的24小时采食量、体重和体长进行测定。根据体重和体长值计算大鼠Lee’s指数。安乐死:在第52天时将所有大鼠安乐死(0.13 mg/kg盐酸赛拉嗪麻醉状态下,腹主动脉放血法),分离腹脂、肝脏并称重,计算腹脂率和肝脏指数。组织样品采集:采集腹部脂肪、下丘脑、腿部肌肉、肝脏各1～3g,保存在-80℃冰箱中;另外,采集胰腺、皮下脂肪浸泡于4%福尔马林中。(4)血清抗体水平测定通过交叉连续稀释法确定ELISA中显色剂和抗原包被剂的最佳浓度。随后利用ELASA方法检测血清中抗体滴度。(5)耐糖量测试分别在实验第0、28、50天(耐糖量测试前禁食6小时),大鼠腹腔注射葡萄糖2g/kg,分别在0、15、30、60、120分钟用雅培freestyle FREEDOM血糖仪测定血糖含量。(6)血液(血清)生化检测:总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、甘油三酯(triglyceride,TG)、血糖、血清钙(calcium,Ca)和磷(phosphorus,Pi);血清性激素,包括促卵泡成熟激素(follicle stimulating hormone,FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、催乳素(prolactin,PRL)、雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progesterone,P)、睾酮(testosterone,T);相关代谢激素,包括生长激素(growth hormone,GH)、皮质醇、瘦素、胰岛素、胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)、胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-1)、胰高血糖素(glucagon,GC)、游离三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游离甲状腺素(free thyroxineIndex,FT4)。(7)肝脏中甘油三酯的含量测定根据购自南京建成生物工程研究所组织甘油三酯测定试剂盒说明书进行。①肝脏组织裂解;②肝脏组织裂解的处理;③甘油三酯的含量测定。(8)组织病理学检测:①肝脏冰冻切片制备和油红O染色;②皮下、腹部脂肪组织的石蜡切片与HE染色;③免疫组织化学染色技术检测胰腺中胰岛素(7)代谢相关基因的定量检测Trizol法提取总RNA并反转录为cDNA,经过PCR鉴定和反应条件摸索后用于RT-PCR法检测神经肽Y(neuropeptideY,NPY)、阿片-促黑素细胞皮质素原(proopiomelanocortin,POMC)、解偶联蛋白 3(Uncoupling protein 3,UCP3)、Lep、促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)、促性腺激素释放激素受体(gonadotropin-releasing hormone receptor,GnRHR)、类固醇调节元件结合蛋白 1(sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome pruliferators activated receptor γ,PPARy)基因表达量,记录各个基因扩增的的ct值。β-actin作为内参。定量PCR体系:上下游引物(20μmol/L)各 0.2μL、反转录产物 1μL、ddH20 8.56μL,SYBRgreen-Taq 10μL,50×ROX 0.04μL。定量循环条件:50℃ 2min,95℃ 2min,[95℃ 15s,60℃(β-actin)或 63℃(POMC)或 57℃(NPY)或 62℃(GnRH)或 68℃(GnRHR)或 54℃(Lep)或 57℃(UCP3)或 55℃(SREBP-1)30s]40 个循环。(8)Western-blotting方法检测下丘脑和肝脏瘦素受体信号通路相关蛋白的表达实体组织蛋白的提取并进行蛋白含量的测定,SDS-PAGE电泳分离蛋白,转膜并利用特异性抗体进行免疫反应,随后进行化学发光、胶片显影、定影,最后将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目的条带的灰度值。(9)实验数据处理与分析数据统计分析与作图软件:SPSS13.0和Original 8.0;数据表示方式:平均数±标准差;统计方法:抗体水平、体重、采食量、体长、Lee’s指数、血脂四项、血生化检测、激素检测和耐糖量测试数据采用two-way ANOVA进行统计分析;其余数据采用one-way ANOVA进行统计分析;组间两两比较采用LSD法;P<0.05表示差异显著;P<0.001表示差异极显著;图片编辑与处理软件:Image-pro plus 6.0 和 ImageJ2X。结果(1)血清抗体水平测定在第一次免疫前,对照组与实验组大鼠血清中的抗体水平比较低。第一次免疫后第7天,免疫瘦素受体组和免疫瘦素组大鼠血清中的抗体水平迅速上升,随后,免疫瘦素受体组和免疫瘦素组分别在实验第42天和28天,抗体水平进入高峰阶段,直到实验结束均维持在OD450为0.8～1的水平。以上结果证明免疫瘦素受体或瘦素后,能成功激活SD大鼠体内产生免疫应答反应并产生抗体。(2)采食量、体重、体长、Lee’s指数、腹脂率和肝脏指数随着日龄的增长,实验组与对照组体长、体重和采食量均增加。第一次免疫后第7天免疫瘦素组和免疫瘦受体组采食量均随着抗体水平的升高而快速上升。在实验第52天(实验结束),免疫瘦素组和免疫瘦素受体组采食量分别要比对照组(20.07±1.62g)多约9%和8%,实验组采食量增多幅度更大;免疫瘦素组的体重要比对照组(231.87±10.3g)重15%;而整个实验期间免疫瘦素受体组与对照组体重组间差异不显著,不具有统计学意义(P>0.05)。整个实验期间无论是免疫瘦素受体组还是免疫瘦素组都与对照组体长组间差异不显著,不具有统计学意义(P>0.05)。证明三组SD大鼠的生长速度是基本一致的。从实验的第21天开始至52天(实验结束),免疫瘦素组SD大鼠Lee’s指数显著高于对照组,并具有统计学意义(P<0.05)。而免疫瘦素受体组只在实验的第35、42天,Lee’s指数比对照组低,且组间统计学差异显著(P<0.05)。免疫瘦素组的腹部脂肪重量和腹脂率与对照组(4.18± 1.54g)相比较,分别高约42%和24%,且腹部脂肪重量和腹脂率组间差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。而免疫瘦素受体组平均腹脂重量和腹脂率与对照组比较不具统计学差异(P>0.05)。与对照组(8.18±0.89g)相比较,免疫瘦素组肝脏重量高约10%,组间具有统计学差异(P<0.05);而肝脏指数对照组(3.53±0.38%)却比免疫瘦素组稍高,但这两组组间不具有统计学差异(P>0.05)。与对照组比较,免疫瘦素受体组肝脏重量和肝脏指数都稍低,但两组组间差异也不具有统计学差异(P>0.05)。(3)血生化检测和激素检测血脂四项检测结果显示,实验结束时,与对照组比较,免疫瘦素组总胆固醇高25%、低密度脂蛋白高28%、甘油三酯高54%,这三项指标组间统计学差异显著(P<0.05),提示免疫瘦素组出现高脂血症。而免疫瘦素受体后,只有甘油三酯的含量比对照组(0.99±0.32mmol/L)低13%左右,且组间统计学差异显著(P<0.05),血脂四项的其他指标与对照组比较不具有统计学差异(P>0.05)。血糖检测结果显示,实验期间免疫瘦素受体组与对照组比较血糖组间差异不显著,不具有统计学意义(P>0.05)。而免疫瘦素组血糖从实验第21天开始至52天(实验结束),显著高于对照组(P<0.05)。实验结束时,免疫瘦素组比对照组(4.87±0.53mmol/L)血糖高 18%。耐糖量测试结果表明,在第一次免疫前(实验第0天),KLH对照组、免疫瘦素受体组和免疫瘦素组耐糖量正常。实验的第28天和50天,对照组和免疫瘦素受体组耐糖量正常;而免疫瘦素组在实验第28天、50天的空腹血糖与对照组比较升高了 30%左右,120min时血糖仍然没有下降至正常水平,表现为糖耐量受损(impaired glucose tolerance,IGT)。血清Ca和Pi检测结果显示,在实验结束时(实验的第52天),免疫瘦素组血清Ca含量(0.8±0.06 mmol/L)只有KLH对照组的三分之一,组间差异十分显著(P<0.0001);血清钙磷比例(Ca/Pi)和钙磷乘积(CaXPi)均相应的减少。而免疫瘦素受体组血清Ca、Ca/Pi和Ca×Pi与对照组比较,均不具有统计学差异(P>0.05)。性激素六项检测结果显示,与对照组相比,免疫瘦素组FSH、LH、E2减少(P<0.05),而T则增高(P<0.05);而免疫瘦素受体则FSH的增高(P<0.05),其他项目组间两两比较均不具有统计学差异(P>0.05)。代谢相关激素检测结果显示,与对照组相比较,免疫瘦素受体组血清中GH、IGF-1分别升高52%、18%(P<0.05);而免疫瘦素组血清中皮质醇、瘦素分别升高1.41和3.1倍(P<0.05),IGF-1和胰岛素则降低27%和66%(P<0.05)。无论免疫瘦素受体组还是免疫瘦素组血清中CCK 比对照组相比少了 62%和25%(P<0.05)。(4)组织病理学检测肝脏冰冻切片(油红O染色)结果显示,免疫瘦素受体组与KLH对照组肝脏甘油三酯含量、脂肪细胞面积、肝细胞脂变率比较,组间不具有统计学差异(P>0.05)。而免疫瘦素组肝脏甘油三酯含量比KLH对照组高43%。免疫瘦素组肝脏脂肪细胞覆盖的面积和肝细胞脂肪变率分别约是对照组的8倍和3.3倍。提示免疫瘦素后SD大鼠出现脂肪肝病症。皮下和腹部脂肪石蜡切片(HE染色)结果显示,免疫瘦素受体组单个皮下脂肪细胞和单个腹部脂肪细胞面积分别比KLH对照组小22%和32%(P<0.05);而单个视野皮下脂肪细胞数量和单个视野腹部脂肪细胞数量则分别比KLH对照组多23%和20%(P<0.05)。另外,免疫瘦素组单个皮下脂肪细胞和单个腹部脂肪细胞面积分别比KLH对照组大80%和40%(P<0.05);而单个视野皮下脂肪细胞数量和单个视野腹部脂肪细胞数量则分别比KLH对照组少31%和22%(P<0.05)。免疫组织化学染色技术检测胰腺胰岛中胰岛素结果显示,免疫瘦素受体SD大鼠β细胞胰岛素分泌增多(P<0.05);而免疫瘦素组SD大鼠单个胰岛出现萎缩的现象,β细胞胰岛素分泌的量减少(P<0.05)。(5)荧光定量 PCR 检测下丘脑 POMC、NPY、PPAYγ、GnRH、GnRHR 和腿部肌肉UCP3、腹部脂肪Lep和肝脏SREBP-1的mRNA表达量结果显示,无论免疫瘦素受体组还是免疫瘦素组下丘脑POMC/NPY 比值均减少,分别只有对照组的72%和76%,组间具有统计学差异(P<0.05)。与KLH对照组比较,免疫瘦素受体或瘦素后,PPAYγ的表达量增加了将近50%(P<0.05)。免疫瘦素组下丘脑中GnRH mRNA表达量要比对照组少一倍(P<0.05)。免疫瘦素受体组下丘脑中GnRHR mRNA表达量比对照组显著高约24%(P<0.05);其它基因实验组与对照组比较组间无统计学差异(P>0.05)。与对照组相比较,免疫瘦素受体组肝脏SREBP-1表达量减少近一倍,而免疫瘦素组增加40%(P<0.05)。(6)Western-blotting方法检测下丘脑和肝脏中Janus激酶2(Janus Kinase 2,Jak2)、信号转导子和转录激活因子 3(Signal transducer and activator of transcription 3,Stat3)、信号转导子和转录激活因子 5(Signal transducer and activator of transcription 5,Stat5)、和磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)表达量结果显示,除了 p-Stat3和p-PI3K蛋白组间有统计学差异外,其它两种蛋白实验组与对照组之间差异均不显著(P>0.05)。免疫瘦素受体后SD大鼠下丘脑中p-STat3蛋白表达量显著高于对照组4.1倍;而与下丘脑p-STat3蛋白表达情况不同,无论免疫瘦素受体还是免疫瘦素后,SD大鼠肝脏中p-STat3蛋白表达量都显著高于对照组。免疫瘦素后,p-PI3K蛋白在SD大鼠下丘脑中的表达量只有对照组的十一分之一(P<0.0001);在肝脏中的表达量减少了 42%(P<0.05);而免疫瘦素受体后变化不显著(P>0.05)。结论(1)免疫瘦素受体后,激活了 SD大鼠瘦素受体Jak2/Stat3信号通路并上调PPARy、GnRHR基因mRNA表达以及下调SREBP-1基因mRNA表达,从而刺激FSH、GH和IGF-1的分泌,起到降低TG和抑制脂肪在腹部、皮下、肝脏沉积的作用;POMC/NPY 比例及血清CCK降低,导致食欲增加,但体重维持正常。免疫瘦素受体也许会给肥胖防治研究提供一条新的研究思路。(2)本研究首次利用瘦素免疫法制备大鼠代谢综合症模型,很好的模拟了人类以肥胖为标志的代谢性疾病病症,发现免疫瘦素后,SD大鼠出现瘦素抵抗现象,体内高水平的瘦素破坏了胰岛β细胞分泌胰岛素的功能,使胰岛素分泌不足,从而削弱了由瘦素-胰岛素所介导Stat3、PI3K信号转导功能,造成耐糖量受损;GnRH基因mRNA表达下调,导致FSH、LH、E2、IGF-1分泌减少和皮质醇、T分泌的增多;SREBP-1基因mRNA表达上调,肝脏沉积的增加;POMC/NPY 比例及血清CCK降低,导致食欲、体重增加和脂肪在血液、腹部、皮下脂肪沉积增加。