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背景与目的近年来,肺癌的发病率呈逐年上升的态势。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌所有病例的80%以上。由于常发生远处转移,肺癌患者的5年生存率只有15%左右。淋巴结转移是决定肺癌患者预后的主要因素。随着医学分子生物学理论和技术的发展,针对肺癌转移机制的靶向分子生物学研究取得了较大的进展,但引导肺癌细胞定向迁移的确切机制仍有待研究。CCR7是CC类趋化因子受体的成员之一,其配体CCL21特异的高表达于淋巴结的高内皮静脉(high endothelial venules, HEV)及淋巴管内皮中。CCL21/CCR7在免疫和炎症反应的淋巴细胞定向迁移中发挥关键作用。最近的研究发现CCL21/CCR7在肿瘤转移中的作用令人瞩目,研究证实CCL21/CCR7在黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌、结直肠癌、甲状腺癌、子宫颈癌和慢性淋巴细胞白血病的淋巴结转移中发挥重要作用。已有研究者在NSCLC组织中检测到CCR7 mRNA的表达,但其是否参与了肺癌淋巴结转移的过程还不得而知。为此本研究拟应用免疫组化检测肺癌组织中CCR7及血管内皮生长因子-C (Vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)蛋白的表达,并分析其与NSCLC临床病理参数的关系,然后构建表达CCR7的质粒载体,并稳定转染A549细胞,进而检测CCL21/CCR7轴对A549细胞增殖、钙内流、迁移、侵袭、转移相关因子表达及体内淋巴结转移的影响。探讨CCL21/CCR7在肺癌淋巴结转移中的作用与机制,为探索肺癌新的治疗方法提供理论和实验依据。方法1.收集65例NSCLC患者手术切除组织存档蜡块。免疫组化法分别检测肺癌组织中CCR7和VEGF-C蛋白的表达,分析其与肺癌临床病理参数的关系,并进一步探讨CCR7联合VEGF-C检测在诊断NSCLC淋巴结转移中的价值。2.设计和构建能表达CCR7 cDNA的质粒载体(pEGFP-CCR7),并以不表达任何基因的pEGFP-N1质粒为阴性对照,分别通过脂质体介导转染至A549细胞,经G418筛选(800μg/mL)并稳定传代后,采用WST-1、软琼脂集落形成实验、激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)和Boyden小室模型,检测CCL21对A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞体外增殖、钙内流、迁移和侵袭的影响;然后应用Real-Time RT-PCR和Western blot检测CCL21对A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞转移相关因子表达的影响。3.将A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞等比例混合,并种植裸鼠爪垫皮下,一周后Real-Time RT-PCR检测各级淋巴结中CCR7相对于原位肿瘤组织的表达量,比较A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞较早淋巴结转移能力。采用裸鼠爪垫皮下种植淋巴结转移模型,比较A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞经淋巴道晚期发生淋巴结转移的能力,以及对荷瘤裸鼠生存期的影响。结果1. CCR7和VEGF-C蛋白在NSCLC组织中均有较高表达,分别达56.9%和60%。CCR7和VEGF-C蛋白在NSCLC中的表达呈正相关(P<0.01),而且两者的表达水平均随肺癌组织TNM分期升高及伴有淋巴结转移的发生而逐渐增强(P<0.01)。联合检测CCR7和VEGF-C在诊断NSCLC淋巴结转移中的准确度是比较高的,ROC曲线下面积达0.782。2.培养基中无CCL21存在的情况下A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞体外增殖、钙内流、迁移和侵袭能力均无显著差异(P>0.05);在CCL21作用下,与A549-pEGFP细胞相比A549-CCR7细胞的体外增殖、钙内流、迁移和侵袭能力均显著增强(P<0.01)。这提示CCL21/CCR7轴能够增强A549细胞的体外增殖、钙内流、迁移和侵袭能力。在不表达CCR7的情况下,有无CCL21对A549细胞VEGF-C、MMPs和TIMPs的表达均无明显影响(P>0.05);而在表达CCR7的情况下,CCL21能够显著增强A549细胞VEGF-C、MMP-2、9、11的表达(P<0.01或0.05),显著降低TIMP-1,2的表达(P<0.01或0.05),但对MMP-1的表达无明显影响(P>0.05)。3.腘窝、髂动脉旁以及肾门淋巴结中A549-CCR7细胞的比例均显著高于原位肿瘤组织(P<0.01),而且随着淋巴结的级数增高,A549-CCR7细胞所占比例有增高的趋势。与A549-pEGFP细胞相比,A549-CCR7细胞的荷瘤裸鼠生存期显著缩短(P<0.01),淋巴结转移率显著提高(P<0.01)。提示CCL21/CCR7轴能够显著增强A549细胞经淋巴道发生淋巴结转移的能力。结论1. CCR7可作为诊断NSCLC淋巴结转移的新型标志物,其与VEGF-C联合检测有助于NSCLC淋巴结转移的早期诊断和确定手术时的切除范围。2. CCL21/CCR7轴促进A549细胞的体外增殖、钙内流、迁移和侵袭。3. CCL21/CCR7轴促进VEGF-C、MMP-2、9、11的表达,抑制TIMP-1, 2的表达,其促进NSCLC淋巴结转移可能与其调控VEGF-C,MMPs及TIMPs的表达有关。4. CCL21/CCR7轴能够增强A549细胞裸鼠移植瘤经淋巴道发生淋巴结转移的能力。