论文部分内容阅读
目的:选取合适的人前列腺癌细胞系建立体外失巢凋亡耐受细胞模型,探究CEMIP对前列腺癌细胞失巢凋亡、锚定非依赖性生长、迁移及侵袭能力的影响。方法:用超低粘附细胞培养板(ULAP)悬浮培养人前列腺癌PC-3、DU145、C4-2、LNCa P细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。Transwell小室法检测PC-3、DU145、C4-2、LNCa P细胞迁移及侵袭能力。用PC-3和DU145两种细胞系建立失巢凋亡耐受模型,通过sh RNA沉默CEMIP的表达,CCK-8法检测亲本细胞、失巢凋亡耐受细胞及沉默CEMIP细胞在ULAP中存活及增殖能力。采用流式细胞学检测沉默CEMIP对失巢凋亡耐受细胞抗凋亡能力的影响。软琼脂克隆实验检测沉默CEMIP对失巢凋亡耐受细胞锚定非依赖性生长能力的影响。Western blotting法检测亲本细胞、失巢凋亡耐受细胞及沉默CEMIP细胞裂解的CEMIP、PARP和caspase-3蛋白表达量。采用Transwell小室法检测沉默CEMIP对失巢凋亡耐受细胞迁移及侵袭能力的影响。结果:通过流式细胞仪对PC-3、DU145、C4-2、LNCa P四种细胞系的检测表明,PC-3和DU145有一定的失巢凋亡耐受能力,C4-2和LNCa P在悬浮培养条件下凋亡率较高。Transwell小室法表明PC-3和DU145细胞迁移、侵袭能力要高于C4-2和LNCa P;CCK8法表明在悬浮培养条件下失巢凋亡耐受细胞的细胞增殖率显著高于对应亲本细胞或沉默CEMIP的细胞;流式细胞学检测在悬浮培养条件下表明失巢凋亡耐受细胞的凋亡率显著低于对应亲本细胞或沉默CEMIP的细胞。软琼脂克隆实验表明沉默CEMIP可显著抑制失巢凋亡耐受细胞的克隆形成率。Western blotting结果表明,失巢凋亡耐受细胞的CEMIP表达水平明显高于对应的亲本细胞,构建的sh RNA可显著沉默其表达水平。CEMIP高表达可抑制激活型PARP和激活型Caspase-3蛋白表达。Transwell小室法表明沉默CEMIP可抑制失巢凋亡耐受细胞的迁移、侵袭能力。结论:PC-3和DU145细胞适合建立失巢凋亡耐受的细胞模型,CEMIP可抑制细胞失巢凋亡、促进锚定非依赖性生长、促进细胞迁移和侵袭。目的:研究细胞脱离胞外基质状态下CEMIP对细胞氧化应激水平及谷氨酰胺转运能力的影响。方法:利用sh RNA沉默失巢凋亡耐受细胞CEMIP的表达,用超低粘附培养板悬浮培养细胞一定时间,进行后续实验:1、利用荧光探针DCFH-DA对细胞进行染色,通过荧光显微镜及流式细胞仪分别检测细胞ROS水平;2、使用Mito SOXTM红色试剂染色,荧光显微镜下检测细胞内线粒体超氧化物水平;3、单细胞凝胶电泳法检测细胞DNA损伤水平;4、JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位;5、GSH和GSSG检测试剂盒检测细胞内GSH/GSSG水平;6、利用CCK8法检测促氧化剂及抗氧化剂对细胞存活的影响;7、利用谷氨酰胺检测试剂盒测定不同时间点培养基中谷氨酰胺浓度。另外,分别用含谷氨酰胺培养基和不含谷氨酰胺培养基培养失巢凋亡耐受细胞及CEMIP沉默的细胞,CCK8法检测谷氨酰胺对细胞存活的影响,GSH和GSSG检测试剂盒检测细胞内GSH/GSSG水平变化。结果:沉默失巢凋亡耐受细胞的CEMIP表达后,在悬浮培养条件下细胞内ROS水平显著增高,线粒体超氧化物水平增高,DNA损伤程度明显增高,线粒体膜电位下降,GSH/GSSG比率降低。促氧化剂能进一步降低CEMIP沉默后细胞存活率,而抗氧化剂能逆转CEMIP沉默后细胞存活率的下降水平。沉默CEMIP表达后,失巢凋亡耐受细胞对培养基中谷氨酰胺的消耗水平降低。谷氨酰胺剥夺条件下悬浮培养失巢凋亡耐受细胞可导致存活率下降,GSH/GSSG比率降低。结论:CEMIP可能通过促进细胞谷氨酰胺的摄取从而降低细胞“失巢”状态下氧化应激水平,促进细胞的存活。目的:研究CEMIP影响谷氨酰胺转运促进前列腺癌细胞失巢凋亡耐受的分子机制方法:实时荧光定量PCR检测沉默CEMIP后失巢凋亡耐受的前列腺癌细胞谷氨酰胺转运体(SLC1A5、SLC7A5、SLC38A3、SLC38A5)表达量变化。采用western blotting的方法进一步证实SLC1A5蛋白量表达的变化。利用人前列腺癌组织芯片进行免疫组织化学染色,研究SLC1A5蛋白在正常组织与前列腺癌组织中表达量的变化。通过Oncomine和The Human Protein Atlas数据库对SLC1A5在前列腺癌及癌旁组织中表达水平差异进行研究,对SLC1A5对前列腺癌生存与后进行研究。采用western blotting法检测ERK、p-ERK、c-MYC蛋白的表达差异。沉默CEMIP表达后再进行SLC1A5过表达功能实验,western blotting检测细胞SLC1A5蛋白表达改变,GSH和GSSG检测试剂盒检测细胞内GSH/GSSG水平。结果:实时荧光定量PCR和western blotting的方法检测证实沉默CEMIP后SLC1A5的m RNA和蛋白表达量均显著降低。组织芯片结果表明前列腺癌组织中SLC1A5的表达量显著高于癌旁组织。沉默CEMIP后失巢凋亡耐受的前列腺癌细胞中p-ERK、c-MYC蛋白的表达水平降低。沉默CEMIP表达后再进行SLC1A5过表达,结果表明GSH/GSSG降低的情况可被逆转。结论:CEMIP通过调控ERK/c-MYC/SLC1A5通路影响谷氨酰胺转运,从而促进前列腺癌细胞失巢凋亡耐受。