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L-瓜氨酸是参与尿素循环的重要中间代谢物,对于维持人体血氨平衡发挥重要作用。随着研究的深入,发现L-瓜氨酸在治疗肝脏昏迷、类风湿关节炎诊断、抗氧化、异体排斥效应指示剂等领域有重要应用前景。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种基因组中含有高G+C量的革兰氏阳性菌,广泛用于L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-精氨酸等氨基酸工业生产。21世纪以来,C.glutamicum ATCC13032全基因组的成功测序为深入研究谷氨酸棒杆菌基因结构和表达调控打开了方便之门。本课题以谷氨酸棒杆菌标准菌株C.glutamicumATCC13032为研究对象,考察分析其L-瓜氨酸的生物合成代谢途径,对其进行了一系列代谢工程改造,构建L-瓜氨酸高产菌,主要结果如下: (1)采用pK18 mobsacB质粒介导的同源重组敲除系统,敲除L-瓜氨酸代谢支路的第一个基因—精氨酸琥珀酸合成酶基因argG,阻断瓜氨酸利用途径,在代谢途径上实现L-瓜氨酸的积累。营养缺陷功能验证:argG基因敲除后,菌体正常生长需要额外添加L-精氨酸,为精氨酸营养缺陷型。重组菌C.glutamicumATCC13032-△argG(CIT-1)摇瓶发酵结果表明:重组菌CIT-1能够同时积累L-瓜氨酸2.2g/L,L-谷氨酸12.5g/L,L-丙氨酸3.2g/L,L-脯氨酸2.8g/L。 (2)通过敲除谷氨酸棒杆菌阻遏蛋白基因argR,系列分析了L-瓜氨酸合成途径的去阻遏作用。在构建好argR基因缺失菌株C.glutamicum ATCC13032-△argG-△argR(CIT-2)中,测定了谷氨酸棒杆菌合成L-瓜氨酸相关酶基因簇中各合成酶活力水平,结果表明去阻遏后argC,argJ,argB,argD和argF基因的表达量都得到不同水平的提高。L-瓜氨酸合成能力也明显高于ArgR阻遏型菌株,发酵60 h时L-瓜氨酸产量为4.6g/L,证明argR缺失可以提高谷氨酸棒杆菌L-瓜氨酸的合成。 (3)确定瓜氨酸对谷氨酸棒杆菌N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)存在反馈抑制作用。40mM的瓜氨酸可以降低谷氨酸棒杆菌NAGK酶活力50%。另外,实验证实来源于大肠杆菌的NAGK不受瓜氨酸浓度的反馈抑制作用,所以通过构建过表达来源于大肠杆菌NAGK的菌株C.glutamicum ATCC13032-△argG-△argR-pXMJ19-argB(ec)(CIT-3),对其进行摇瓶发酵实验,72h发酵结束时L-瓜氨酸产量达到8.5g/L,L-谷氨酸3.5g/L,L-丙氨酸2.4g/L,L-脯氨酸2.2g/L。大肠杆菌NAGK的异源过表达不仅有效解除了NAGK的反馈抑制,提高了L-瓜氨酸的产量,同时也降低了谷氨酸的积累。