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1前言百草枯(Paraquat,PQ),化学名称1,1’-二甲基-4,4’-联吡啶阳离子盐,是一种非选择性、接触性的除草剂。在最近几年,服用PQ自杀或意外中毒的发生率在一些亚洲国家特别是中国呈现增加的趋势。虽然目前关于PQ中毒的体内或体外相关研究有很多,但是对于PQ诱导肺损伤发病的分子机制还不完全清楚。因此,研究PQ诱导的肺泡上皮细胞损伤的分子机制可以为将来更好的治疗PQ中毒提供有用的理论基础和新的治疗靶点。PQ无论是在体内实验或体外实验中均表现出诱导细胞凋亡的性质。凋亡所起的作用是通过消除损伤或异常的细胞,进而来维持内环境的稳态。但在很多疾病的发展进程中有异常凋亡的参与。肺泡上皮细胞在PQ中毒早期阶段的凋亡增加是其后发生肺损伤和肺间质纤维化的关键性事件。PQ通过损伤叶绿体干扰光合作用来对绿色植物发挥毒性作用。PQ通过损伤线粒体来实现对哺乳动物细胞的毒性作用。细胞凋亡的发生可直接由线粒体功能障碍所触发。与此同时被称为线粒体自噬的过程即通过溶酶体对损伤的线粒体进行降解的过程也可以对损伤的线粒体进行清除。对受损线粒体的及时清除有助于细胞稳态的恢复,避免进一步的细胞坏死或凋亡。P53在内源性凋亡途径介导的信号转导通路中起重要的作用。当细胞受到外界凋亡刺激时,P53的表达增加,P53可通过转录依赖途径调节Bcl-2家族蛋白的表达,也可直接作用于线粒体介导的细胞凋亡。最近也有研究报道P53通过与线粒体自噬通路蛋白Parkin的相互作用抑制Parkin介导的线粒体自噬来干扰损伤线粒体的清除。在本研究中选用人肺上皮样细胞A549作为研究PQ诱导肺损伤的体外模型,观察其凋亡过程是否涉及线粒体凋亡途径与线粒体自噬途径。进一步探讨PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是否起保护作用以及P53抑制剂pifithrin-α(PFT-α)是否能通过减弱线粒体凋亡信号通路的活性与促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通路,来改善线粒体功能障碍,减少细胞凋亡。2材料与方法2.1实验材料细胞株:人肺上皮样细胞A549。2.2实验分组2.2.1 PQ诱导A549细胞凋亡模型建立与线粒体凋亡途径相关指标的检测实验分组:对照组(等量PBS)、PQ50μM组、PQ100μM组、PQ150μM组、PQ200μM组。各组细胞处理24h、48h后,检测相关指标。2.2.2 PFT-α通过线粒体凋亡途径减弱PQ诱导的A549细胞凋亡实验分组:对照组(0.1%DMSO)、PFT-α(30μM)预处理组、PQ(200μM)组、PFT-α(30μM)+PQ(200μM)组。各组细胞孵育24h后检测相关指标。2.2.3 PQ诱导A549细胞凋亡过程中线粒体自噬途径相关指标的检测实验分组:对照组(加入等量PBS)、PQ50μM组、PQ100μM组、PQ150μM组、PQ200μM组。各组细胞培养24h后检测相关指标。2.2.4 PINK1/Parkin通路在PQ诱导的A549细胞凋亡中的作用实验分组为:对照组(等量PBS)、si RNA组(Parkin siRNA转染)、PQ(200μM)组、PQ(200μM)+siRNA(Parkin siRNA转染)组。各组细胞培养24h后检测相关指标。2.2.5 PFT-α通过线粒体自噬途径减弱PQ诱导的A549细胞凋亡实验分组:对照组(0.1%DMSO)、PFT-α(30μM)预处理组、PQ(200μM)组、PFT-α(30μM)+PQ(200μM)组。各组细胞孵育24h后检测相关指标。2.3主要研究方法2.3.1 PQ诱导A549细胞凋亡模型建立与线粒体凋亡途径相关指标的检测(1)A549细胞培养并选用不同浓度的PQ处理。(2)MTT法检测细胞活性。(3)Hoechst 33258染色,荧光显微镜观察细胞核的形态;凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。(4)Rh123染色后,荧光显微镜观察线粒体膜电位;以及使用流式细胞仪检测荧光强度。(5)使用Caspases活性检测试剂盒检测Caspase-3/-9活性。(6)Western blot检测Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-XL、β-actin蛋白表达量的变化。2.3.2 PFT-α通过线粒体凋亡途径减弱PQ诱导的A549细胞凋亡(1)Western blot检测P53蛋白表达量的变化。(2)使用PFT-α预处理,检测凋亡率、线粒体膜电位、Caspase-3/-9活性。(3)使用PFT-α预处理,Western blot检测Bax、Bcl-2、β-actin蛋白表达量的变化。2.3.3 PQ诱导A549细胞凋亡过程中线粒体自噬途径相关指标的检测(1)Mito Tracker Green(MTG)与Lyso Tracker Red(LTR)染色,荧光显微镜观察线粒体自噬。(2)Western blot检测PINK1、Parkin、P62、LC3B、COXIV、β-actin蛋白表达量的变化。2.3.4 PINK1/Parkin通路在PQ诱导的A549细胞凋亡中的作用通过转染siRNA沉默Parkin基因,Western blot检测Parkin蛋白的表达情况;进一步检测在沉默Parkin基因后,PQ对细胞凋亡率与Caspase-3/-9活性的影响。2.3.5 PFT-α通过线粒体自噬途径减弱PQ诱导的A549细胞凋亡使用PFT-α预处理,Western blot检测PINK1、Parkin、P62、LC3B、COXIV、β-actin蛋白表达量的变化。3结果3.1 PQ诱导A549细胞凋亡模型建立与线粒体凋亡途径相关指标的检测(1)PQ对A549细胞具有明显的细胞毒性,细胞活性和PQ作用时间和浓度呈依赖性方式降低。(2)Hoechst 33258染色发现PQ引起细胞核的固缩与裂解;细胞的凋亡率和PQ作用时间和浓度呈依赖性方式升高。(3)通过荧光显微镜与流式细胞仪观察线粒体膜电位的变化,结果均显示细胞的线粒体膜电位和PQ作用时间和浓度呈依赖性方式降低。(4)A549细胞Caspase-3与Caspase-9活性和PQ作用时间和浓度呈依赖性方式增加。(5)Western blot检测显示PQ处理后Bax、Bak的表达显著增加;Bcl-2、Bcl-XL的表达显著降低。3.2 PFT-α通过线粒体凋亡途径减弱PQ诱导的A549细胞凋亡(1)Western blot检测显示PQ处理后P53的表达显著增加。(2)PFT-α预处理显著降低PQ引起的细胞凋亡率与线粒体膜电位的破坏并且抑制了Caspase-3与Caspase-9活性。(3)PFT-α预处理显著降低Bax/Bcl-2相对蛋白水平比例。3.3 PQ诱导A549细胞凋亡过程中线粒体自噬途径相关指标的检测(1)使用MTG和LTR在A549细胞中共染色,然后通过荧光显微镜分析显示PQ处理后线粒体自噬明显增强。(2)Western blot检测显示PQ处理后PINK1、Total Parkin、Mito Parkin、LC3-II/LC3-I的表达显著增加;P62的表达显著降低。3.4 PINK1/Parkin通路在PQ诱导的A549细胞凋亡中的作用沉默Parkin基因后,总Parkin蛋白的表达受抑制;通过Parkin特异性siRNA预处理细胞再接受PQ处理与单独PQ处理相比,前者具有更高的细胞凋亡率并且Caspase-3与Caspase-9活性显著增加。3.5 PFT-α通过线粒体自噬途径减弱PQ诱导的A549细胞凋亡PFT-α预处理再接受PQ处理A549细胞,线粒体自噬相关蛋白Mito Parkin与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达增加。4结论(1)PQ通过激活线粒体凋亡通路诱导A549细胞凋亡。(2)PQ诱导A549细胞凋亡中同时也激活线粒体自噬。(3)PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在PQ诱导的A549细胞损伤中起到直接的保护作用。(4)P53抑制剂PFT-α通过线粒体凋亡途径与PINK1/Parkin途径减弱PQ诱导的A549细胞凋亡。