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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)俗称“猪蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的一种以仔猪呼吸障碍、母猪繁殖障碍和公猪精液品质下降为特征的高度传染性疾病。因PRRSV的高度变异性和对宿主的免疫抑制性,导致PRRS的防控效果不佳,给养猪业带来了巨大的经济损失,成为影响养猪业健康发展的头号传染病。然而,在2006年全国PRRS爆发期间,我国通城县境内的种畜场和某商品猪场饲养的地方品种——通城猪却无一例因该病感染而死亡,表现出对PRRS的抗病性。因此,本研究利用PRRSV Wu H3人工感染5周龄的通城猪和大白猪为研究对象,记录临床症状,测定血常规和血清细胞因子变化,对PRRSV靶细胞(猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs))、生殖器官(睾丸)及外周免疫器官(腹股沟淋巴结和脾脏)进行转录组测序,并通过蛋白组测序对腹股沟淋巴结的数据进行验证。本研究拟通过PRRSV人工感染试验对通城猪和大白猪两个品种感染后免疫应答差异进行研究,为PRRS抗病遗传机制研究奠定基础,取得的主要结果如下:1.通城猪和大白猪人工感染PRRSV后的临床症状、血常规指标、细胞因子的差异分析本研究选取5周龄通城猪和大白猪各12头,利用PRRSV Wu H3肌肉注射感染,观察其临床症状,检测血常规和血清细胞因子变化。感染组通城猪临床症状和肺组织损伤较轻,感染后食量减少,但能自行饮水或采食,血清病毒增殖高峰出现在感染后第五天,其最高病毒载量仅为大白猪最高值的0.4倍,血常规指标波动不大,血清细胞因子IFN-γ第五至七天上升至67pg/m L。而大白猪在感染后出现明显呼吸困难、共济失调、食欲废绝等症状,并且在感染后第七天出现死亡病例,病毒增殖高峰出现在第三天,血常规指标红细胞计数显著升高,白细胞计数、淋巴细胞百分比和血小板计数显著下降,这些现象与大白猪感染后多组织器官严重出血有关。血清中未检测到IFN-γ,可能是其较高水平的IL-10和IL-12p40抑制了IFN-γ的分泌,不利于病毒清除。2.通城猪和大白猪感染PRRSV后肺泡巨噬细胞、脾脏、腹股沟淋巴结和睾丸的转录水平差异分析感染后第7天屠宰全部试验动物,并筛选12头猪(两个品种的感染组和对照组各3头)的PAMs、腹股沟淋巴结、脾脏和睾丸组织分别进行组织切片、转录组测序,主要结果如下:(1)PAMs转录组测序获得个体数据量在11-16G之间,两个品种的对照组之间差异表达基因686个,感染组之间804个,通城猪感染前后1806个,大白猪2155个。通城猪差异表达基因富集于吞噬小体、白细胞渗出和凋亡等通路,而大白猪差异表达基因下调比例大,富集于S1P、G蛋白和PI3K-Akt等通路。这些通路提示,通城猪PAMs中MHC分子表达水平较高,有利于抗原呈递,促进白细胞渗出迁移至感染部位,引起免疫反应,并通过抑制细胞凋亡保证细胞生存和抗原呈递效率,以尽快清除病毒;大白猪吞噬小体形成通路受抑制程度较高,导致抗原呈递能力下降,同时,被抑制的S1P和G蛋白通过抑制PI3K-Akt通路,抑制了下游免疫应答反应。(2)睾丸组织病毒载量检测结果显示,通城猪睾丸病毒载量显著低于大白猪,差值高达30倍。组织病理切片显示,通城猪曲细精管直径和面积极显著大于大白猪,睾丸间质很窄,曲细精管中普遍能明显看到不同发育阶段的生精细胞。这提示同周龄的通城猪睾丸组织血睾屏障形成早,其在该阶段时结构上的优势有利于该年龄段的仔通城猪表现出对PRRSV的抗病性。而血清睾酮水平检测也表明通城猪睾酮水平均在3.74 ng/m L以上,显著高于大白猪。进一步的睾丸组织转录组测序获得了16-23G的个体数据量,两个品种对照组之间差异表达基因6315个,感染组之间6777个,通城猪感染组和对照组之间差异表达基因739个,大白猪1493个。两对照组之间差异表达基因约有2/3在通城猪中表达水平更高,这些差异表达基因主要富集于生精细胞发生及合成代谢等生殖细胞发育通路中,也提示通城猪睾丸发育较早。感染后,通城猪差异表达基因和富集的免疫相关通路均较少,可能是睾丸组织的免疫豁免机制发挥了保护作用;而大白猪TNF、JAK-STAT、TLRs、NF-κB、T细胞和B细胞等通路及白介素普遍上调,但并未能抑制PRRSV在睾丸中的增殖。(3)腹股沟淋巴结和脾脏组织的病毒载量检测和病理切片显示通城猪这两个组织病毒载量均较低,大白猪腹股沟淋巴结坏死细胞比例更大。转录组测序获得两个品种腹股沟淋巴结对照组之间差异表达基因464个,脾脏对照组之间2909个;通城猪腹股沟淋巴结感染前后差异表达基因3802个,大白猪2532个;通城猪脾脏感染前后1814个,大白猪2021个。腹股沟淋巴结对照组中MHC-I类分子、TNF-α、B细胞受体、Ig A、Ig G等在通城猪中表达水平较高。感染后,通城猪中MHC-II类分子、T细胞受体、C3补体及代谢通路中的大量基因表达量更高,细胞代谢、吞噬小体和NF-κB通路均被激活。而大白猪下调基因更多,TNF-α、PI3K-Akt、T细胞受体和NF-κB等通路均被抑制。这些提示,通城猪的腹股沟淋巴结中细胞代谢较强,细胞受体表达水平高,有利于识别抗原并激活下游通路;而大白猪中MHC分子被抑制,未能显著激活细胞表面受体,导致PI3K-Akt、NF-κB和MAPK等通路未能有效发挥作用,TNF-α引起的细胞凋亡蛋白激活,也是其免疫抑制的可能原因之一。脾脏中通路富集情况与腹股沟淋巴结类似,此外,通城猪脾脏中大量代谢相关基因表达水平较高,可能为机体快速识别抗原刺激和激活抗病毒基因提供保障。3.通城猪和大白猪感染PRRSV后腹股沟淋巴结的蛋白水平差异分析为进一步鉴定腹股沟淋巴结转录组测序所富集的基因和通路,本研究又对腹股沟淋巴结进行了蛋白组定量研究,获得两个品种对照组之间差异表达蛋白426个,感染组之间332个,通城猪感染组和对照组之间差异表达蛋白865个,大白猪1103个。这些差异表达蛋白富集通路包括细胞代谢、吞噬小体、ECM受体和抗原呈递等,与转录组中差异表达基因富集通路较类似。通城猪补体蛋白、MHC家族及T、B细胞表面受体表达量均在感染前或感染后普遍高于大白猪,而大白猪ECM-受体及G蛋白中大量蛋白下调表达,导致下游PI3K-Akt通路未能显著激活,这些通路与转录组预测结果较为一致。以上研究对通城猪和大白猪人工感染PRRSV后的临床表现、血常规指标、细胞因子、转录水平和蛋白水平变化进行了系统的比较,发现通城猪对PRRSV的耐受性可能与其MHC分子、T细胞表面受体、B细胞表面受体表达量较高及细胞代谢较强有关,而大白猪ECM受体普遍下调,PI3K-Akt、NF-κB和G蛋白通路普遍受抑制,是其免疫被抑制的可能原因;通城猪睾丸组织病毒载量非常低,这可能与其发育较早、睾酮水平较高有关。本研究对靶细胞、生殖器官和外周免疫器官分别进行了比较,筛选出大量差异表达基因,为PRRSV致病机制研究提供了参考,为优质种质资源发掘提供了依据。