骨质疏松是以骨的力学强度减弱为标志的骨骼系统紊乱疾病,骨量低、骨易碎、骨组织微环境退化,其骨折风险显著增加；随着老龄化社会的到来,骨质疏松已经成为一个全球性的健康问题。中药用于治疗骨折和骨关节疾病已经有几千年的历史。骨碎补始载于唐《本草拾遗》,各地民间广泛用于补肾强骨、续伤止痛等疾病；然而活性成分、物质基础和作用机制尚不清楚。淫羊藿始载于《神农本草经》,有温肾壮阳、强筋骨、祛风湿的功效；动物试验结果和临床数据一致表明心叶淫羊藿(Epimedium brevieornum Maxim.)的总黄酮提取物能够同时提高皮质骨、松质骨的骨密度和骨强度,并且没有发现对生殖系统的副作用。本论文第二章研究骨碎补中抗骨质疏松的活性成分；第三章探求心叶淫羊藿黄酮提取物中抗骨质疏松的活性物质基础及其作用机制。　　 本论文第二章采用小鼠去卵巢(ovariectomized,OVX)骨质疏松模型和体外促成骨样细胞增殖的细胞模型研究骨碎补药材槲蕨[Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm]干燥根茎的60％乙醇提取物的抗骨质疏松活性,进而确定活性部位；首次从骨碎补的活性部位(大孔树脂30％、50％和95％乙醇洗脱馏分)分离得到43个化合物,并通过理化性质和现代波谱学手段(UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR等)鉴定了它们的结构,分别为柚皮苷(naringin)(1),新北美圣草苷(neoeriocitrin)(2),柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(narigenin-7-O-β—D—glucoside)(3),5,7,3’,5’-四羟基二氢黄酮-7-O-β—D-吡喃葡萄糖苷(5,7,3’,5’-tetrahydroxy-flavanone7-O-β—D—glucopyranoside)(4),柚皮素(naringenin)(5),5,7,3’,4’-四羟基二氢黄酮(eriodictyol)(6),kushennol F(7),sophoraflavanone G(8),kurarinone(9),leachianone A(IO),木犀草素-7-O-新橙皮糖苷(luteolin7-O-neohesperidoside)(11),金鱼草素-6-新橙皮糖苷(aureusidin-6-O-neohesperidoside)(12),山柰酚-7-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(kacmpferol-7一O-α-L-arabinofuranoside)(13*),8-异戊烯基山柰酚(8-prenylkaempferol)(14),山柰酚(kaempferole)(15),山柰酚-3-O-α-L-毗喃鼠李糖苷(kaempferol-3一O-α—L-rhamnopyranoside)(16),黄芪苷(astraglin)(17),山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-L-呋喃阿拉伯糖苷(kaempferol3-O-β—D-glucopyranoside-7-O-L-arabinofuranoside)(18*),5,7-二羟基色原酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5,7-dihydroxychromone-7-O-β-D-glucopyranoside)(19),5,7-二羟基色原酮-7-O-新橙皮糖苷(5,7-dihydroxychromone-7-O-neohesperidoside)(20),山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(kaempferol3-O-β-D-glucopyranoside-7-O-β-D-glucopyranoside)(21),xanthogalenol(22),儿茶素 catechin(23),(E)-4-O-β-D-葡萄糖酰咖啡酸[(E)-4-O-β-D-glucopyranosyl caffeic acid](24),(E)-4-β-D-吡喃葡萄糖基松针酸[(E)-4-O-β-D-glucopyranosyl sinapoic acid](25),4-O-β-D-吡喃葡萄基阿魏酸苷(4-O-β-D-glucopyranosyl ferulic acid)(26),反式咖啡酸(trans-caffeic acid)(27),4-O-β-D-吡喃葡萄糖基香豆酸(4-O-β-D-glucopyranosyl coumaric acid)(28),二氢异阿魏酸(dihydroisoferulicacid)(29),二氢咖啡酸(dihydrocaffeic acid)(30),3,4-二羟基苯甲酸(3,4-dihydroxyl benzoicacid)(31),4-O-β-D-吡喃葡萄糖基香草酸(4-O-β-D—glucosyl vanillic acid)(32),5-ethoxy-2-hydroxy-benzoate(33),3-(acetylamino)-4-hydroxy-benzoic acid(34),12-caffeoyldodecanoic acid(35*),β-谷甾醇(β-sitosterol)(36),maltol glucoside07),1,2-benzenedicarboxylic acid diisobutyl ester(38),1,2,3,4,6-五氧没食子酰基-β-D-葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)(39),1,2,3,4,-四氧没食子酰基-β-D-葡萄糖(1,2,3,4,6-tetra-O-galloyl-β-D—glucose)(40),2,3,4,6-四氧没食子酰基-α-D-葡萄糖(2,3,4,6-tetra—O-galloyl—α-D-glucose)(41),palmarumycin JCl(42),山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(kaempferol3-O-α—L-rhamnoside-7-O-β-D-glucopyranoside)(43)。　　 43个化合物中,黄酮类化合物24个、苯丙素和苯甲酸类化合物10个、鞣质3个、其他类型化合物6个。其中化合物18、35为新化合物,其余除化合物1、2、24、36外均为首次从该属(drynaria)植物中分离得到。对上述化合物,UMR106细胞MTT及碱性磷酸酶(ALP)实验显示黄酮类化合物能够促进UMR106成骨样细胞的增殖和分化,而苯丙素和苯甲酸类化合物则不具有上述活性；同时提取物指纹图谱显示黄酮类化合物为活性部位的主要化学成分,提示黄酮类化合物可能是中药骨碎补中抗骨质疏松的活性物质基础。动物实验结果显示骨碎补中的主要活性成分之一柚皮苷能够显著增加骨密度和骨强度,并且不促进子宫增生。利用选择性雌激素受体α(ERα)拮抗剂MPP和选择性雌激素受体β(ERβ)激动剂DPN作为工具药对柚皮苷促进UMR106细胞ALP活性进行信号通路研究,发现柚皮苷可能通过拮抗ERβ,同时激动ERα起到促进骨形成的作用。　　 综上所述,本论文第二章在确定活性部位的基础上对传统中药骨碎补药材槲蕨的化学成分进行了研究,并且阐明了其主要的活性物质为黄酮类化合物,动物实验结果证实其主要活性成分之一柚皮苷能够提高骨密度增加骨强度,且不促进子宫增生,体外细胞实验提示柚皮苷可能通过雌激素受体信号通路促进骨形成,该研究为该骨碎补的进一步开发和利用奠定了前期研究基础。　　 本论文第三章利用HPLC-MS/MS方法对淫羊藿黄酮提取物进行化学成分分析,其中92.7％峰面积的化学成分得已指认,共鉴定了7个化合物,均为异戊烯基黄酮苷类化合物。随后利用HPLC-MS/MS进一步研究发现该提取物在家兔血清中的代谢产物为淫羊藿次苷Ⅱ和脱水淫羊藿素。在体外细胞培养实验中比较了代谢前后的化合物对成骨样细胞增殖和分化的影响,其中脱水淫羊藿素促进成骨样细胞碱性磷酸酶作用最强,提示脱水淫羊藿素(Icaritin)可能是淫羊藿黄酮提取物在体内发挥作用的重要活性物质。此外,计算机辅助模拟受体-配体对接实验显示脱水淫羊藿素可以很好地和ERβ结合。体外细胞培养实验进一步证实脱水淫羊藿素可以促进骨膜细胞碱性磷酸酶活性和钙沉积,拮抗ERβ信号通路比激动ERα的信号通路更多地参与其中。另外,脱水淫羊藿素能够促进成骨样细胞UMR106细胞分化,抑制破骨样细胞RAW264.7形成破骨细胞,同时抑制破骨细胞的骨吸收功能,均与其拮抗ERβ信号通路相关。综上所述,脱水淫羊藿素具有促进骨形成和抑制骨吸收的作用,是淫羊藿黄酮提取物抗骨质疏松作用的及其重要的活性物质形式,其作用机制涉及拈抗ERβ信号通路。脱水淫羊藿素可能是一种具有新的作用机制的潜在的治疗绝经后骨质疏松的药物。