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当三个终止密码子UAA、UAG和UGA中的任何一个进入核糖体的A位点时,蛋白质翻译终止发生。在使用标准遗传密码子的生物中,真核生物第一类肽链释放因子(eukaryotic polypeptide release factor,eRF1)可以完全识别三个终止密码子,但是密码子变异的物种或细胞器中终止密码子发生了重新分配。纤毛虫eRF1只能识别UAA、UAG和UGA中的一个或两个。在高等真核细胞中,eRF1的N端结构域(domain 1)已被证明在蛋白质合成的终止过程中负责识别mRNA上的终止密码子,其中3个高度保守的模体结构域GT区,TASNIKS区和YCF区,对eRF1识别终止密码子的活性有较大影响。但具体哪些氨基酸或者模体负责三个终止密码子的识别仍然没有一致的结论。关于第一类肽链释放因子的识别机制目前尽管建立了几种模型,但几种模型之间仍然有诸多矛盾,各种模型也不够完善,还需要更为确定的数据来证实哪些序列参与终止密码子的识别以及识别的方式。为了鉴定第一类肽链释放因子中识别终止密码子的关键的氨基酸位点,我们选用通用密码子物种(standard code species)的eRF1,如酵母(Saccharomyces cerevisae)和肠肾虫(Nycototherus ovalis)的eRF1,以及变异密码子物种(variant code species)的eRF1,如八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)和四膜虫(Tetrahymena thermophilia)作为研究材料。其中八肋游仆虫将UGA编码为半胱氨酸,而四膜虫只将UGA作为终止密码子。我们设计了两种实验方案。第一是将纤毛虫八肋游仆虫eRF1的N端结构域中的关键的氨基酸位点逐一突变为肠肾虫、四膜虫和酵母eRF1的对应位点的氨基酸。第二个方案是将酵母的eRF1的N端结构域的关键的氨基酸位点分别突变为肠肾虫、四膜虫和游仆虫eRF1对应位点的氨基酸。分析这些氨基酸位点的改变对eRF1性质和功能的影响。研究的氨基酸位点有第57位、60位、61位、70位和126位(以人氨基酸序列计数)。研究方法主要是5氟乳清酸平板法和双荧光素酶(萤火虫和海肾荧光素酶基因)报告系统。前者用以分析突变体eRF1支持细胞生存的活性,后者分析突变体eRF1对于三个终止密码子的通读效率。使用酵母菌株YDB447(eRF1基因敲除型)为工具菌。研究结果显示,这些突变体eRF1的识别活性发生了显著变化。当游仆虫eRF1(Eo/Sc eRF1)中引入A70S时,不能支持酵母细胞的生长,对UGA的通读效率达到了23.4%,是野生型的两倍左右,当继续引入I126L、E60S与S61N之后,得到的组合突变体Eo/Sc eRF1(E60S/S61N/A70S/I126L)(对应于酵母氨基酸位点)可以支持酵母的生长,和野生型的生长情况相当,并且Eo/Sc eRF1可以识别三个终止密码子UAA、UAG和UGA,通读效率分别为0.16%、0.16%、0.05%。结果表明,就细胞的生长而言,eRF1上两个模体TASNIKS(第55-61氨基酸)与Y×C××F(第122-128位氨基酸)对终止密码子的识别是起协同作用的。向Eo/Sc eRF1中引入A70S和I126F(类似于四膜虫eRF1氨基酸)后,突变体识别UGA的活性明显降低,通读效率达到35.8%。当酵母eRF1(Sc eRF1)中引入G57S和L126F(类似于四膜虫氨基酸位点)后,得到的eRF1突变体对UAA,UAG和UGA的通读效率都有所提高,分别达到0.99%,0.83%和3.22%,是野生型Sc eRF1的4-8倍:当引入S70A与L126I后(类似于游仆虫氨基酸位点),Sc eRF1突变体对UGA表现出了15.96%的通读效率,是野生型的35倍,对UAA和UAG的通读却没有表现出明显的变化,产生了类似于游仆虫的密码子识别模式,进一步说明S70A/L126I在决定肽链释放因子识别活性中的关键作用。由此可见,eRF1的N端结构域中的关键的氨基酸位点对于eRF1的性质和功能具有决定性的作用,尤其是第70位和第126位的氨基酸。在NIKS模体中的氨基酸位点对eRF1的功能也具有一定的影响。该结果支持了cavity模型,为进一步研究肽链释放因子识别终止密码子的机制提供大量数据。其次,本研究进一步分析了蛋白质的翻译后修饰对第一类肽链释放因子功能的影响。利用赭纤虫(Blepharisma japonicum)eRF1(Bj-eRF1)为材料,预测发现,赭纤虫eRF1和酵母eRF1的N端的一些与密码子识别有关的氨基酸被磷酸化修饰的几率很高,且二者磷酸化修饰的氨基酸位点有所差异。用基因突变方法向Bj-eRF1中引入磷酸化激酶识别位点,或者删除其自身可能的憐酸化激酶识别位点,分析了磷酸化修饰对BJ-eRF1识别密码子特异性的影响。当向赭纤虫eRF1的N端引入与酵母eRF1一致的磷酸化位点时(N23S/D25E/A70S/Q115E),其识别终止密码子的特异性发生了显著的改变,对UGA识别的通读效率显著降低,对UGA、UAG、UAA通读效率分别为5.71%、1.59%和0.20%,由UAA/UAG识别特异性转变为UAA/UAG/UGA三个密码子全识别。说明这些位点磷酸化可能参与调节eRF1识别终止密码子的过程。