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甲基环戊二烯羰基锰（methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl，MMT）是一种汽车燃油添加剂，可以提高燃油的品质，降低成本。1995年，美国环境保护署批准MMT可作为汽油抗爆剂替代四乙基铅用于无铅汽油。随着无铅汽油在全世界范围内的广泛使用，新型汽油防爆剂MMT的人体毒性逐步得到重视。目前研究表明，MMT存在一定的神经毒性，因此，有必要深入研究MMT的神经毒性机制并寻找相应的防治药物。SK-N-SH细胞作为人神经母细胞瘤细胞株，被广泛用于人神经细胞增殖、发育、凋亡等方面的实验。灯盏乙素是灯盏花的主要有效成分，为黄岑素苷小分子结构。近年研究表明，灯盏乙素对老年痴呆症有治疗作用，提示灯盏乙素具有神经保护作用。本实验利用体外培养的SK-N-SH神经细胞模型研究MMT的神经毒性作用及分子机制以及灯盏乙素的体外保护作用。本研究分为两个部分：
实验一：MMT诱导SK-N-SH细胞凋亡的分子机制研究。利用MMT诱导SK-N-SH细胞后，MTT法检测细胞存活率，分光光度法检测活性氧(ROS)生成，化学发光法检测Caspase-3活性，Western blot法检测p38 MAPK磷酸化程度。结果显示，1.0mmol/LMMT诱导SK-N-SH细胞4，8，12，24，36，48h后，细胞存活率明显下降并与诱导时间呈正相关(P＜0.01)；同时0.2，0.5，1.0，1.5，2mmol/L的MMT分别诱导SK-N-SH细胞24h后也导致细胞存活率下降并与诱导浓度呈正相关(P＜0.01)。1.0mmol/L MMT诱导SK-N-SH细胞24h后，细胞ROS生成量为正常组的5.2倍(P＜0.01)；抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)及二硫苏糖醇(DTT)可有效抑制细胞ROS生成(P＜0.01)，提高细胞存活率(P＜0.01)；在这一过程中，Capase-3活性明显增强，为对照组的3.01倍(P＜0.01)；同时p38 MAPK磷酸化程度加强；p38 MAPK特异性抑制剂SB203580可提高细胞存活率(P＜0.05)，抑制Caspase-3的活性(P＜0.01)。结论：MMT诱导的SK-N-SH细胞凋亡与ROS升高，激活Caspase-3有关，这一过程有p38 MAPK相关信号转导途径参与。
实验二：灯盏乙素对MMT诱导SK-N-SH神经细胞凋亡的保护作用研究。将SK-N-SH细胞随机分为5组：正常组，MMT诱导组，1.2×10-1mg/L灯盏乙素组，3.0×10-2mg/L灯盏乙素组，7.5×10-3mg/L灯盏乙素组。灯盏乙素预保护2h，1mmol/L MMT诱导24h后，MTT法检测细胞存活率，分光光度法检测细胞ROS生成、细胞培养液和细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)产量，化学发光法检测细胞三磷酸腺苷(ATP)释放量及Caspase-3活性变化。结果显示，灯盏乙素预保护的细胞在MMT诱导后，与MMT诱导组相比，细胞存活率上升(P＜0.05)，细胞ROS生成量受到抑制(P＜0.01)；细胞培养液和细胞内SOD活性增高(P＜0.05)，MDA产量降低(P＜0.01)；在这一过程中，细胞ATP的释放量有所恢复(P＜0.05)，同时Capase-3活性受到抑制(P＜0.05)。结论：灯盏乙素通过抗氧化作用，抑制MMT诱导SK-N-SH细胞的凋亡作用。以上研究结果表明，MMT可通过促进ROS生成诱导SK-N-SH神经细胞凋亡，Caspase-3和p38 MAPK参与了这一过程，抗氧化剂灯盏乙素对MMT诱导SK-N-SH神经细胞凋亡具有保护作用。