【摘 要】
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在新型冠状病毒(COVID-19)爆发后,如何建立一种新的快速灵敏的病原体检测方法引起越来越多的关注。RT-PCR被认为是病原体检测的黄金方法,但该方法需要复杂的样品前处理,专业的仪器和操作人员以及大量的时间。面对全球性爆发的COVID-19病毒,迫切需要一种依赖简单仪器即可实现快速检测的方法。本文建立了一种基于合成的核苷酸探针结合化学发光体系实现对病原体核酸快速检测的方法,主要研究内容如下:首先
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在新型冠状病毒(COVID-19)爆发后,如何建立一种新的快速灵敏的病原体检测方法引起越来越多的关注。RT-PCR被认为是病原体检测的黄金方法,但该方法需要复杂的样品前处理,专业的仪器和操作人员以及大量的时间。面对全球性爆发的COVID-19病毒,迫切需要一种依赖简单仪器即可实现快速检测的方法。本文建立了一种基于合成的核苷酸探针结合化学发光体系实现对病原体核酸快速检测的方法,主要研究内容如下:首先设计合成了一种新的嵌合核苷酸探针dAP4AA。该探针通过焦磷酸键偶联脱氧腺苷三磷酸(dATP)和2-磷酸-L-抗坏血酸(AAP)。通过N,N-二甲基甲酰胺(CDI)活化磷酸基团的方法合成了dAP4AA核苷酸探针,产率为45%。预期dAP4AA在DNA聚合酶(Kf exo-)和碱性磷酸酶(r SAP)作用下可以产生易于检测的抗坏血酸分子(AA),结合Luminol-H2O2-CoOOH化学发光体系中发光信号的变化实现对病原体核酸的高灵敏检测。实验证明dAP4AA探针是DNA聚合酶的底物,可以用于DNA链的扩增,同时碱性磷酸酶不能催化dAP4AA的水解,而只能水解DNA聚合酶反应后的产物AAP3,生成AA,进而通过对AA的检测实现对目标核酸分子的检测。通过结合磁性纳米粒子,可以实现对目的短片段DNA的检测。利用该方法可以有效的检测到体系中60 fM乙型肝炎病毒(HBV)核酸片段。该方法与环介导的等温扩增(LAMP)联合使用,可以实现对体系中COVID-19核酸片段DNA 10个拷贝数的检测,与使用传统的荧光染料比较,灵敏度可以提高1-2个数量级;反应时间3min即可得到比较明显的检测信号,达到快速检测病原体的目的。以该实验为基础,将继续优化反应条件,开发一种小型手持式测试仪器,实现更便捷的病原体检测。
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