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目的1、构建靶向抑制Ndst1和Hs2st表达的RNA干扰载体2、观察抑制Ndst1和Hs2st表达对前列腺癌细胞系Myc-CaP生物学行为的影响3、初步探讨抑制Ndst1和Hs2st表达对前列腺癌细胞系Myc-CaP生物学行为影响的机制方法1、靶向抑制Ndst1和Hs2st表达的RNA干扰载体的构建、筛选和鉴定利用软件OligoEngine Workstation对Ndst1和Hs2st的mRNA序列进行分析,针对每个序列分别设计并合成3条备选干扰序列,与siRNA真核表达载体pSUPER.retro.neo+GFP进行重组,构建RNA干扰载体pSUPER-Ndst1和pSUPER-Hs2st。用干扰载体转染前列腺癌Myc-CaP细胞后,通过检测各转染组细胞中Ndst1和Hs2st的mRNA和蛋白表达情况,筛选出抑制效果最显著的干扰载体用于后续实验研究。2、靶向抑制Ndst1和Hs2st表达对前列腺癌细胞系Myc-CaP生物学行为影响的体外实验研究采用CCK-8法和细胞计数法绘制细胞生长曲线、软胶克隆形成实验和流式细胞仪检测细胞周期等实验方法,比较对照组和实验组Myc-CaP细胞的增殖能力；利用Transwell迁移实验、细胞划痕愈合实验和Transwell侵袭实验分别对对照组和实验组Myc-CaP细胞的迁移和侵袭能力进行观察；另外,采用Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞仪检测了各转染组Myc-CaP细胞的凋亡。3、靶向抑制Ndst1和Hs2st表达对前列腺癌细胞系Myc-CaP生物学行为影响的体内实验研究将Ndst1和Hs2st敲低后的Myc-CaP细胞注射到裸鼠背部皮下,观察移植瘤的生成和生长情况。解剖出移植瘤组织,通过BrdU标记法检测瘤体细胞增殖情况,利用TUNEL法检测移植瘤细胞的凋亡情况。将Ndst1和Hs2st敲低后的Myc-CaP细胞用荧光染料染色,从尾静脉注射入裸鼠体内,3小时后解剖出肺组织进行冰冻切片,镜下观察短期肺转移情况。4、靶向抑制Ndst1和Hs2st表达对前列腺癌细胞系Myc-CaP生物学行为影响的机制初探将生长因子FGF-2与生物素结合后,加入Ndst1和Hs2st敲低后的Myc-CaP细胞中孵育,然后用R-藻红蛋白-抗生物素蛋白链菌素与生物素结合,用流式细胞仪检测FGF-2与Ndst1和Hs2st敲低后Myc-CaP细胞的结合能力。另外,我们还检测了FGF-2对Ndst1和Hs2st敲低前后的Myc-CaP细胞在生长、迁移和凋亡方面的作用变化。结果1、成功构建了靶向抑制Ndst1和Hs2st表达的RNA干扰载体：pSUPER-Ndst1和pSUPER-Hs2st,对Ndst1和Hs2st表达的抑制率分别为85.6%和80.2%。2、体外实验中,抑制Ndst1表达后的Myc-CaP细胞生长速度变慢；克隆形成能力降低46.2%迁移和侵袭能力分别降低30.0%和17.1%；凋亡率升高1.2倍。3、体外实验中,抑制Hs2st表达后的Myc-CaP细胞生长速度变慢；克隆形成能力降低81.2%；迁移和侵袭能力分别降低69.6%和69.5%。凋亡率升高2.9倍。4、裸鼠体内实验中,抑制Ndst1表达后的Myc-CaP细胞生长速度变慢,细胞增殖能力降低39.3%；短期肺转移能力降低40.8%；凋亡率升高1.6倍。5、裸鼠体内实验中,抑制Hs2st表达后的Myc-CaP细胞生长速度变慢,细胞增殖能力降低50.2%；短期肺转移能力降低65.6%；凋亡率升高5.9倍。6、抑制Ndst1或Hs2st表达后的Myc-CaP细胞与FGF-2的结合能力下降,分别为对照组Myc-CaP细胞的79.5%和38.8%。7、加入FGF-2 (20ng/ml)后,抑制Ndst1或Hs2st表达的Myc-CaP细胞生长速度加快,但明显比对照组慢；对照组、Ndst1组和Hs2st组Myc-CaP细胞迁移能力分别增加5.8、3.6和2.1倍；凋亡率分别下降了81.9%、51.4%和22.0%。结论1、抑制Ndst1或Hs2st表达能够降低Myc-CaP细胞在体内外的增殖、迁移和侵袭能力,促进其凋亡,其中抑制Hs2st表达对Myc-CaP细胞产生的影响更明显。2、抑制Ndst1或Hs2st表达后的Myc-CaP细胞对生长因子FGF-2的结合能力和反应能力下降,这可能是其生物学行为改变的机制之一。