第一部分　造血干细胞治疗多发性硬化的临床和实验研究 目的: 多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是主要以T细胞介导的局灶性中枢神经系统白质脱髓鞘、少突胶质细胞和轴突损害为特点的自身免疫性疾病。虽然MS有不同的临床表现，但是50％的患者在发病后15年内将不能单独行走。MS的常规疗法有免疫调节和免疫抑制等，但是长期的免疫抑制治疗易出现明显的副作用，而且长期的免疫抑制治疗的效果也存在争议。β干扰素和glatiramer acetate能够减少MS复发的次数，但是这些方法不能阻止MS病情发展成进展阶段，而且常规方法对进展型MS常常是无效的。因此，由于常规方法治疗的局限性，临床上需要新的治疗方法来阻止MS的进展性病情发展。自体外周造干细胞移植(autologous peripheral haematopoietic stem cell transplantation，APHSCT)是近年来发展迅猛的一项治疗技术，造血干细胞移植(haematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是治疗自身免疫性疾病有效方法。HSCT能够重建自身免疫性疾病的异常的免疫功能。异基因HSCT治疗MS能够根除不正常的免疫功能，建立新的、对神经系统免疫耐受的免疫系统，而APHSCT可以使患者回到疾病潜伏期或仅有遗传缺陷的状态，APHSCT可能具有Time Shift的作用。随着造血干细胞(haematopoietic stem cell，HSC)移植技术的提高，APHSCT的死亡率已经大大下降，有些移植中心可以达到基本无死亡。APHSCT治疗MS最大的问题是复发。现在研究的证据表明树突状细胞(dendritic cell，DC)的重建是HSCT后宿主免疫功能恢复和决定治疗效果的一个关键因素。事实上，有研究表明HSCT后DC数目的降低是HSCT后疾病复发和死亡率增高的原因之一，而且，其它的研究说明HSCT后DC数目的增高不但能够加速T淋巴细胞的植入，而且促进造血干细胞的分化，例如增高新生T淋巴细胞的数量。本课题研究造血干细胞移植治疗MS的动物试验和临床研究。在临床研究上，研究APHSCT治疗MS临床应用的治疗效果和安全性，以及免疫学、MRI和神经电生理方面的改变。在动物研究上，应用骨髓细胞移植(主要依靠造血干细胞重建造血和免疫系统)治疗实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)的模型，通过DC在免疫系统的中心调节作用，研究未成熟DC、MOG35—55抗原冲击致敏的DC及DC促成熟因子对造血干细胞移植后宿主免疫系统重建的影响，试图建立细胞免疫耐受，以提高造血干细胞移植的治疗效果，降低移植后的复发率。 方法: 1、骨髓细胞移植治疗小鼠EAE的实验研究 2、造血干细胞治疗MS的临床研究 结果: 1、DC分离、体外培养和鉴定 (1)体外培养不同时相DC形态： (2)体外培养DC的透射电镜和扫描电镜观察 (3)流式细胞仪检测： 2、抗原冲击致敏的DC 3、EAE模型的建立和症状评估 4、骨髓细胞移植 5、体内诱导外周血T细胞免疫耐受的研究 6、造血干细胞治疗MS的临床研究 结论: 成功地建立了体外大量扩增小鼠骨髓DC以及MOG35—55致敏冲击DC的方法，为研究DC在移植及诱导免疫耐受的作用打下基础。 成功建立C57BL／6小鼠的EAE模型以及骨髓细胞移植治疗EAE的模型，骨髓细胞移植能够明显改善EAE鼠的症状。 在体内，Flt3L有明显刺激总DC和DC1，以及降低DC2的作用，提高外周血TH1细胞因子IFN—γ和IL-12，可以增强免疫反应。单纯DC和MOG—DC有刺激DC2和CD4+CD25+调节性T细胞的作用，提高TH2细胞因子IL-10，可能与免疫耐受有关。 APBSCT治疗MS患者近期治疗效果是明显的，安全性是可靠的，长期疗效仍需进一步随访观察。 　　第二部分　UA和肌苷对MS的临床和实验研究 目的: 近年来，越来越多的学者注意到了过氧化物在神经系统炎症反应在脱髓鞘和轴突损伤中的作用。一氧化氮(nitrogen monoxide，NO)以及同类氧化产物，例如过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，PN／ONOO-)，与MS和EAE的发病机制有关，按照PN的氧化活性，PN被认为在NO损坏中枢神经系统中起主要作用，尿酸(uric acid，UA)是一种内源性抗氧化剂，是PN的特异性清除剂，在MS研究中发现UA对MS有抑制作用，其作用机制未完全阐明，但UA并不能抑制髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)特异性T细胞的增殖，对于MBP抗原的呈递和T细胞对抗原的识别及针对MBP抗体的产生也并不起作用。EAE／MS病情的发展与血脑屏障的破坏、中枢神经系统黏附分子表达上调以及炎症细胞进入中枢神经系统组织有关，提高EAE动物血清UA水平能够降低血脑屏障的通透性和阻止炎症细胞进入中枢神经系统组织。ONOO-依赖的自由基能够直接作用于血脑屏障或血管内皮细胞，因此，ONOO-可能提高黏附分子的表达。有学者把UA看作为MS活动的一个指标，也有研究认为UA与MS活动性无关。而且现在认为MS病人的血清UA水平低于健康人群和其它神经系统疾病(other neurological diseases，OND)，但是，以前的研究没有比较MS患者的UA与OND各种类型的关系，而且，没有考虑年龄和性别这二个影响UA的重要因素。根据以上的考虑，我们研究MS和OND各种类型的血清UA的关系，研究MS患者血清UA水平变化与分型、病程、MRI活动性、EDSS评分和患者性别的关系。并且研究UA和UA前体肌苷对EAE小鼠的治疗作用，应用免疫组化和RT—PCR的方法，观察细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管细胞间粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)表达，以及UA和肌苷对它们的影响，探讨UA和肌苷的治疗机制。 方法: 1、UA治疗小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎的实验研究 2、MS患者血清UA水平的变化以及与OND血清UA水平的比较 结果: 1、EAE模型的建立和症状评估 2、UA和肌苷治疗EAE小鼠 3、高效液相色谱法测定小鼠血浆和脑中UA的浓度 4、ICAM—I和VCAM-1免疫组化以及ICAM-1的RT-PCR研究 5、MS患者血清UA水平的变化以及与神经系统其它疾病血清UA水平的比较 结论: 通过高效液相色谱法测定，UA和肌苷治疗组的血浆和脑中UA的浓度高于未用药的对照组，UA和肌苷治疗EAE小鼠，能够改善神经功能缺损症状，对EAE有治疗作用。 UA和肌苷能够降低ICAM—I和VCAM-1的表达，是UA和肌苷治疗EAE的机制之一。本研究是第一次比较多种神经系统疾病的UA水平，第一次提出在神经系统疾病中，MS的血清UA水平不是最低的，UA对神经系统有神经保护和损害两方面的作用。我们的研究给临床医师提供处理不同神经系统疾病UA水平的依据。