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目的:肿瘤细胞减灭术联合以铂类药物为主的化疗是目前卵巢癌最常用的临床治疗方案,但是多药耐药(multidrug resistance,MDR)的出现往往影响卵巢癌的化疗效果,DC-CIK疗法是过继性细胞免疫疗法(adoptive cellular immunotherapy,ACI)之一,有研究表明DC-CIK不仅对血液肿瘤和多种实体肿瘤细胞有杀伤作用,还可以增加肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性,下调耐药基因MDR1的表达。本研究通过体外培养的树突状细胞(dendritic cells,DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)作用于卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP,观察DC-CIK对SKOV3/DDP细胞的逆转耐药作用及对耐药基因MDR1表达量的影响。方法:1采集健康人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),在体外用重组人干扰素-γ(Recombinant Human interferon-γ,rhIFN-γ)、CD3单克隆抗体(CD3 monoclonal antibody,CD3McAb)、重组人白介素-2(Recombinant Human interleukine-2,rhIL-2)、重组人白介素-1α(Recombinant Human interleukine-1α,rhIL-1α)作用下诱导非贴壁细胞成CIK细胞,用重组人白介素-4(Recombinant Human interleukine-4,rhIL-4)、重组人粒细胞集落刺激因子(Recombinant Human granulocyte-macrophage CSF,rhGM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)作用下诱导培养贴壁细胞成DC细胞。将DC与CIK细胞共培养后,利用相差倒置显微镜观察细胞形态,并采用流式细胞技术(Flow Cytometry,FCM)检测CIK细胞的免疫表型CD3+CD56+及DC细胞免疫表型CD83+、CD86+的表达情况。2采用CCK法分别检测CIK细胞和DC-CIK细胞在效靶比为2.5:1、5:1、10:1、20:1、40:1时对SKOV3/DDP细胞24h的抑制率,计算出CIK细胞及DC-CIK细胞对SKOV3/DDP作用24h后的非细胞毒性浓度IC10。3采用CCK法检测顺铂对不同组靶细胞SKOV3/DDP的抑制作用,设顺铂浓度为1 ug/ml、2 ug/ml、4 ug/ml、8 ug/ml、16 ug/ml、32 ug/ml,靶细胞skov3/ddp分为3组,对照组为skov3/ddp组,实验组1为经非细胞毒性浓度ic10的cik干预后的skov3/ddp细胞组(skov3/ddp+cik),实验组2为经非细胞毒性浓度ic10的dc-cik干预后的skov3/ddp细胞组(skov3/ddp+dc-cik),计算顺铂对各组skov3/ddp细胞的半数抑制浓度ic50,以判断cik和dc-cik细胞能否增加耐药细胞株skov3/ddp对顺铂的敏感性。4采用实时荧光定量pcr分别检测skov3细胞组、skov3/ddp细胞组、skov3/ddp+cik细胞组、skov3/ddp+dc-cik细胞组的耐药基因mdr1表达量的变化。结果:1成功分离出pbmc并诱导培养出成熟dc及cik细胞,于相差倒置显微镜下观察,可见cik细胞大量扩增,部分细胞呈集落样生长,dc细胞呈现出成熟dc细胞典型的毛刺样突起。应用流式细胞技术检测出dc细胞表面有(55.66±5.13)%表达成熟dc特异性表面标志cd83+,有(91.70±3.09)%表达cd86+,cik细胞的cd3+cd56+双阳性率达(56.63±6.21)%,提示大部分dc及cik已成熟;2在效靶比为2.5:1、5:1、10:1、20:1、40:1作用下,cik细胞对卵巢癌耐药株skov3/ddp24h的抑制率分别为(4.33±0.31)%、(8.03±0.57)%、(15.60±0.79)%、(22.14±0.61)%、(38.60±0.40)%,dc-cik细胞对skov3/ddp的抑制率分别为(5.30±0.26)%、(9.97±0.31)%、(19.67±0.47)%、(32.20±0.58)%、(49.40±0.28)%,结果显示随着效靶比的增加,cik细胞及dc-cik细胞对skov3/ddp的杀伤力逐渐增强,两组在2.5:1、5:1时抑制率与对照组相比,差异没有统计学意义(p>0.05),在10:1、20:1、40:1时抑制率与对照组相比,差异有统计学意义(p<0.05);且在同一效靶比下,同源的dc-cik细胞比cik细胞的杀伤作用大,差异有统计学意义(p<0.05);通过线性回归计算出cik和dc-cik对skov3/ddp的ic10分别为7.68:1和5.75:1,根据文献,研究某方法或药物逆耐药作用时一般选取略小于ic10的剂量,因此本实验选取cik细胞及dc-cik细胞对skov3/ddp作用的效靶比为5:1;3cck法检测顺铂对不同组skov3/ddp细胞的抑制作用,cik及dc-cik细胞效靶比为5:1,联合作用于skov3/ddp细胞24h后,算得顺铂对SKOV3/DDP细胞的IC50由22.33ug/ml分别降至14.31ug/ml、11.39ug/ml,逆转耐药倍数分别为1.56倍和1.96倍,增加了SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性;4实时荧光定量PCR检测各组靶细胞中耐药基因MDR1的表达水平,2-△△Ct法计算相对表达量,以卵巢癌非耐药株SKOV3为对照组,表达量为1,耐药株SKOV3/DDP的MDR1呈高表达,表达量为(21.498±3.744),经过CIK细胞及DC-CIK细胞作用后,MDR1表达量均下降,分别为(11.248±3.806)、(7.554±1.821),SKOV3/DDP+DC-CIK细胞组MDR1下降更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1健康人外周血来源的PBMC经过相应的细胞因子诱导及培养后,可以获得成熟DC细胞和大量增殖的CIK细胞,选用流式细胞术检测细胞的免疫表型,鉴定CIK细胞及DC细胞方法简单、可靠。2 CIK细胞及DC-CIK细胞对卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP均有杀伤作用,并且在一定范围内,效靶比越大,效应细胞的杀伤力越大;同一效靶比下,与DC共培养后的DC-CIK细胞比CIK细胞杀伤作用更强,DC细胞可以协同增加CIK细胞的杀伤作用。3 CIK和DC-CIK细胞均可以提高卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP对顺铂的敏感性,部分逆转其耐药作用,均可以下调SKOV3/DDP细胞的耐药基因MDR1,且DC-CIK细胞逆转作用较CIK细胞更强。