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目的:
通过分别检测不同浓度不同时间的桂皮酸对神经母细胞瘤细胞SY5Y及肝癌细胞7721增殖及凋亡作用的影响,阐述中药桂皮酸对上述两种肿瘤细胞的作用;通过检测桂皮酸联合Ndfip1蛋白对上述两种细胞增殖与凋亡的影响以及检测凋亡相关蛋白Caspase-9及Caspase-3的表达变化,初步探讨桂皮酸与Ndfip1联合作用的分子机制。
方法:
1.采用MTT法检测不同浓度不同作用时间的桂皮酸单独及联合Ndfip1对神经母细胞瘤细胞SY5Y及肝癌细胞7721增殖作用的影响。
2.采用流式细胞术检测不同浓度不同作用时间的桂皮酸单独及联合Ndfip1对神经母细胞瘤细胞SY5Y及肝癌细胞7721凋亡作用的影响。
3.采用Western blot检测不同浓度不同作用时间的桂皮酸单独及联合Ndfip1对神经母细胞瘤细胞SY5Y及肝癌细胞7721中凋亡相关蛋白Caspase-9及Caspase-3表达的影响。
结果:
1.桂皮酸及Ndfip1对细胞增殖的影响
(1)桂皮酸的浓度设为0.5、1、2、4、8、15(mmol/L),单独作用于SY5Y细胞12h的抑制率分别为2.82、5.51、12.62、20.13、29.73、42.21(%),联合Ndfip1作用12h抑制率分别为0.77、3.71、8.38、16.68、22.59、33.95(%),各浓度间两两比较生长抑制率差异有显著性(p<0.01);桂皮酸单独作用24h的抑制率分别为12.89、22.23、31.26、37.07、50.77、60.81(%),联合Ndfip1作用24h抑制率分别为4.28、11.14、18.16、23.08、27.71、40.39(%),各浓度间两两比较生长抑制率差异有显著性(p<0.01);桂皮酸单独作用48h的抑制率分别为13.05、32.77、58.27、67.39、73.8、80.43(%),联合Ndfip1作用48h抑制率分别为12.88、24.79、30.63、40.27、50.17、58.75(%),各浓度间两两比较生长抑制率差异有显著性(p<0.01)。
(2)桂皮酸的浓度设为0.5、1、2、4、8、15(mmol/L))单独作用于7721细胞12h的抑制率分别为9.63、11.12、19.52、25.84、30.46、41.95(%),联合Ndfip1作用12h抑制率分别为12.51、26.53、34.19、40.26、48.47、55.04(%),各浓度间两两比较生长抑制率差异有显著性(p<0.01);桂皮酸单独作用24h的抑制率分别为17.23、30.5、36.15、41.77、51.44、65.73(%),联合Ndfip1作用24h抑制率分别为18.71、33.97、47.89、60.14、67.79、83.75(%),各浓度间两两比较生长抑制率差异有显著性(p<0.01);桂皮酸单独作用48h的抑制率分别为22.94、31.3、40、59.94、70.68、89.15(%),联合Ndfip1作用48h抑制率分别为32.11、53.58、66.51、75.47、89.69、95.97(%),各浓度间两两比较生长抑制率差异有显著性(p<0.01)。
2.桂皮酸及Ndfip1对细胞凋亡的影响
(1)桂皮酸单独作用与联合Ndfip1作用均能诱导人神经母细胞瘤细胞株SY5Y凋亡,根据计算出的IC50值,桂皮酸单独作用浓度设置为3mmol/L、7.5mmol/L、15mmol/L时,细胞特异性凋亡率分别为19.01%、28.48%、38.00%;桂皮酸联合Ndfip1浓度在3mmol/L、7.5mmol/L、15mmol/L细胞特异性凋亡率分别为13.91%、21.08%、29.35%,两组比较转染Ndfip1后的SY5Y在相同浓度桂皮酸作用下凋亡率明显下降,差异有显著性(p<0.01)。
(2)桂皮酸单独作用与联合Ndfip1均能诱导人肝癌细胞株7721凋亡,根据计算出的IC50值,桂皮酸单独作用浓度设置为3mmol/L、7.5mmol/L、15mmol/L时细胞特异性凋亡率分别为21.59%、30.31%、40.26%;桂皮酸联合Ndfip1浓度在3mmol/L、7.5mmol/L、15mmol/L细胞特异性凋亡率分别为30.76%、40.86%、58.24%,两组比较,转染Ndfip1后的7721细胞在相同浓度桂皮酸作用下凋亡率明显上升,差异有显著性(p<0.01)。
3.桂皮酸及Ndfip1对凋亡相关蛋白Caspase-9及Caspase-3表达的影响。
桂皮酸浓度在3mmol/L、7.5mmol/L、15mmol/L时单独作用于人神经母细胞瘤细胞SY5Y和人肝癌细胞7721,随着浓度增高或时间延长,Caspase-9及Caspase-3的表达均增加;桂皮酸联合Ndfip1蛋白作用于人神经母细胞瘤SY5Y细胞时,随着浓度增高或时间延长,Caspase-9及Caspase-3的表达水平低于桂皮酸单独作用;桂皮酸联合Ndfip1蛋白作用于人肝癌细胞7721,随着浓度增高或时间延长,Caspase-9及Caspase-3的表达水平高于桂皮酸单独作用。
结论:
1.桂皮酸单独作用对人神经母细胞瘤细胞SY5Y的增殖具有抑制效应,对其凋亡具有促进作用,不同浓度不同时间作用效果具有显著性差异;桂皮酸联合Ndfip1蛋白作用时,细胞增殖抑制率及凋亡率较单独作用有明显下降,说明Ndfip1可以拮抗桂皮酸对SY5Y细胞的促凋亡作用,这与Ndfip1对神经细胞具有的保护作用有一定的关系。
2.桂皮酸单独作用对人肝癌细胞7721的增殖具有抑制效应,对其凋亡具有促进作用,不同浓度不同时间作用效果具有显著性差异;桂皮酸联合Ndfip1蛋白作用时,细胞增殖抑制率及凋亡率较单独作用有明显上升,说明两者的作用可能具有协同效应。
3.桂皮酸单独作用于人神经母细胞瘤细胞SY5Y和人肝癌细胞7721,可上调凋亡相关蛋白Caspase-9及Caspase-3的表达水平,表明桂皮酸促进凋亡作用的机制可能涉及到Caspase-9及Caspase-3相关的途径;桂皮酸联合Ndfip1作用于SH-SYSY细胞时,Cascase-9及Caspase-3的表达较桂皮酸单独作用时减少,表明Ndfip1拮抗桂皮酸对SY5Y细胞的促凋亡作用影响Caspase-9及Caspase-3的表达水平;而桂皮酸联合Ndfip1作用于7721细胞时,Cascase-9及Caspase-3的表达较桂皮酸单独作用时增多,表明两者促进7721细胞凋亡的协同效应与增加Caspase-9及Caspase-3的表达水平有关。
4.由上述结果可见,Ndfip1蛋白兼具对神经细胞的保护作用及对其他肿瘤细胞的促凋亡作用,且均涉及对Caspase-9及Caspase-3的表达水平的调控,其进一步作用机制及转换开关仍有待深入研究。