帕金森病(parkinson’s disease,PD)是全球发病率位居第二的神经系统退行性疾病,其重要的临床病理变化是黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)大量多巴胺(DA)能神经元的丢失以及错折叠的α‐突触核蛋白(α‐synuclein)的过度积累。脑肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin-system,RAS)是循环系统中对机体的生理进行调解的重要机构,在调节神经炎症和DA能神经元退行性病变的过程中发挥重要作用。自噬是一种极其保守的自身降解程序,在调节和维持细胞内循环系统稳定方面起着难以替代的作用的。众多的研究表明,在PD的发病和病情进展中自噬发挥了极其重要的作用,但其确切机制目前任然不清楚。吞蛋白A(Endophilin A)属于Endophilin的家族家族成员。研究发现Endophilin A的缺失可以抑制自噬的发生,而过表达的Endophilin A2可以激活自噬。同时大量证据表明,Endophilin A的敲除会导致转录因子FOXO3a的明显上调,而FOXO3a作为自噬的调节因子之一,在自噬相关基因的转录调控中起着重要作用。另外,我们前期实验在Ang II诱导的DA能神经元损伤模型中发现Endophilin A2的蛋白水平明显降低。以上研究表明,FOXO3a和Endophilin A2之间可能存在密切联系,在PD过程中共同参与了对自噬的调节。鸡豆黄素A(biochanin A,Bioch A)是一种天然的植物雌激素,具有抗氧化、抗感染、抗炎等多种活性作用。前期的课题组实验证明Bioch A具有很好的神经元保护作用,但其作用机制尚未完全明确。目的:观察吞蛋白A2、FOXO3a和自噬相关蛋白在AngⅡ诱导多巴胺能神经元损伤模型中的变化,及Bioch A对AngⅡ诱导DA能神经元损伤小鼠模型的保护作用方法:1.随机的将C57小鼠分为5组:假手术组、AngⅡ1d、AngⅡ3d、AngⅡ5d、AngⅡ7d.以上所有时间点AngⅡ模型组均使用脑立体定位注射仪向小鼠黑质部注射AngⅡ造模,假手术组使用相同的给药方式给予同等容量的生理盐溶液。在脑立体给药手术完成后的第1、3、5、7天分别进行行为学实验检测造模小鼠行为指标的变化。完成各项行为学指标检测后立即将小鼠处死,取脑组织进行后续的各项实验。采用免疫荧光化学法检测DA能神经元的损伤和小胶质细胞的活化情况,与FOXO3a,LC3-Ⅱ的蛋白表达水平。采用western blot方法检测Arg-1(arginase 1,Arg-1)、i NOS、炎症因子IL-1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-6(interleukin-6,IL-6)、TNF-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、Endophilin A2和自噬蛋白Beclin1、P62的蛋白水平,以及p-FOXO3a/FOXO3a和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值变化,最后使用模型组小鼠。2.随机的将C57小鼠分为6组:假手术组、AngⅡ组、坎地沙坦组、AngⅡ+Bioch A(18mg/kg)组、AngⅡ+Bioch A(36mg/kg)组、AngⅡ+Bioch A(72mg/kg)组.除假手术组外,其余各组均使用脑立体定位注射仪向小鼠黑质致密部注射AngⅡ造模,假手术组给予同等容量的生理盐溶液。脑立体注射手术完成后24h后,Bioch A各剂量组均通过灌胃给予对应浓度的药物,给药容量为0.1m L/10g,持续时间为一周。坎地沙坦组灌胃给予坎地沙坦(1.2mg/kg,0.1m L/10g)。第7d进行行为学实验,观测造模小鼠行为指标的变化。行为学指标检测后,处死小鼠,取小鼠脑组织进行后续的各项实验。采用免疫荧光化学法检测DA能神经元的损伤、小胶质细胞的活化情况,与FOXO3a,LC3-Ⅱ的表达。采用western blot方法检测Arg-1、i NOS、炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、Endophilin A2和自噬蛋白P62的蛋白水平,以及p-FOXO3a/FOXO3a的比值的变化。结果:1.对吞蛋白A2、FOXO3a以及自噬信号在AngⅡ诱导多巴胺能神经元损伤模型中变化的研究1).AngⅡ诱导的DA能神经元损伤模型小鼠的行为学变化:与假手术组比较,AngⅡ造模后随着时间的延长小鼠的运动轨迹长度、穿越网格数和站立次数均显露出不同程度的降低;此外,与假手术组比较,小鼠游泳分数也随造模时间的延长而不断下降。以上行为学结果显示,AngⅡ可以损伤小鼠的自发活动以及运动能力.2).AngⅡ诱导的DA能神经元损伤模型小鼠黑质部病理学变化:假手术组DA能神经元细胞个体饱满,数量较多,小胶质细胞基本为静息状态,且形态无很大变化,而AngⅡ模型组黑质部神经元细胞随着造模时间变化逐渐丢失,小胶质细胞的活化数量显著性上升,且其形态也逐渐改变为“阿米巴状”。3).AngⅡ诱导的DA能神经元损伤模型小鼠黑质部Arg-1、i NOS和炎症因子表达的变化:与假手术组比较,AngⅡ模型组Arg-1表达随着造模时间的增加逐渐降低而i NOS的表达不断增加。此外,与假手术组比较,AngⅡ模型组小鼠黑质部炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α的蛋白水平随着造模时间的增加均存在不同程度的升高。4).AngⅡ诱导的DA能神经元损伤模型小鼠黑质部Endophilin A2表达的变化:与假手术组比较,AngⅡ5d、7d组Endophilin A2的表达均明显减少.5).AngⅡ诱导的DA能神经元损伤模型小鼠黑质部FOXO3a蛋白水平以及p-FOXO3a/FOXO3a比值的变化:免疫荧光实验的结果显示,与假手术组比较,AngⅡ3d、5d、7d组FOXO3a的含量显著性升高。同时western blot结果显示,与假手术组比较,AngⅡ5d、7d组p-FOXO3a/FOXO3a的比值均显著性降低。6).AngⅡ诱导的DA能神经元损伤模型小鼠黑质部自噬相关蛋白的变化:免疫荧光结果显示,与假手术组比较,LC3-Ⅱ的含量随AngⅡ造模时间的增加逐渐升高。同时western blot结果显示,与假手术组比较,LC3-Ⅱ与LC3-I比值和Beclin1表达水平均随AngⅡ造模天数的增加逐渐升高,而P62的蛋白水平则随AngⅡ造模天数的增加呈现先下降后增加的趋势。7).AngⅡ诱导的DA能神经元损伤模型小鼠黑质部FOXO3a和LC3-Ⅱ与神经元之间的联系:当FOXO3a与TH共表达时,在TH阳性DA能神经元细胞核中观察到明显的FOXO3a探针的定位;此外,在LC3-Ⅱ与TH共表达时,观察到两个探针的显著共定位。2.Bioch A对AngⅡ诱导的DA能神经元损伤的保护作用及其机制的研究1).Bioch A对AngⅡ模型小鼠行为学的影响:旷场实验数据显示,与AngⅡ模型组比较,给予Bioch A治疗后小鼠运动轨迹长度、穿越网格数和站立次数均表现出不同程度的提高。此外,小鼠游泳实验数据显示,与AngⅡ模型组比较,Bioch A对小鼠游泳分数具有明显提高作用。以上行为学结果显示,Bioch A对AngⅡ诱导DA能神经元损伤小鼠的行为障碍具有改善作用。2).Bioch A对AngⅡ模型小鼠黑质部病理学影响:与AngⅡ模型组比较,Bioch A给药组TH阳性神经元细胞的丢失均有不同程度的降低,且神经元胞体逐渐变得饱满,小胶质细胞的激活程度也明显降低。3).Bioch A对AngⅡ模型小鼠黑质部Arg-1、i NOS和炎症因子的影响:与AngⅡ模型组比较,Bioch A明显抑制了Arg-1的减少同时降低了i NOS的表达,此外炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α的含量均明显降低。4).Bioch A对AngⅡ模型小鼠黑质部Endophilin A2的影响:与AngⅡ模型组比较,给予Bioch A治疗可以明显提高Endophilin A2的表达水平。5).Bioch A对AngⅡ模型小鼠黑质部FOXO3a,p-FOXO3a/FOXO3a的影响:免疫荧光结果显示与AngⅡ模型组比较,Bioch A各剂量组的FOXO3a蛋白含量均出现降低。同时western blot结果显示,与AngⅡ模型组比较,Bioch A组p-FOXO3a/FOXO3a的比值增大。6).Bioch A对AngⅡ模型小鼠黑质部自噬蛋白p62的影响:结果显示,与AngⅡ组比较,给予药物Bioch A治疗可以明显降低P62的蛋白水平。结论:1.AngⅡ诱导了神经炎症的发生和DA能神经元的损伤,其机制可能与Endophilin A2表达减少,FOXO3a-自噬阻断有关2.Bioch A抑制了AngⅡ诱导的神经炎症并保护了损伤的DA能神经元,其机制可能与增加Endophilin A2表达,恢复FOXO3a-自噬的通畅有关。