目的：　　胃癌的发生发展与肿瘤的免疫逃逸密切相关。近年来，日益增多的证据表明，肿瘤细胞有分泌外泌体（exosomes）的能力——肿瘤来源的外泌体（tumor-derived exosomes,TDEs）。TDEs可通过直接抑制免疫细胞或调节相关细胞因子的表达等途径，促进肿瘤的免疫逃逸。因TDEs在肿瘤免疫逃逸中所发挥的重要作用，使其成为肿瘤免疫学领域备受关注的研究热点。　　髓系来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）是近年来发现的机体免疫系统中重要的免疫抑制细胞，研究发现MDSCs在肿瘤生长期间大量扩增，扩增的骨髓细胞可致肿瘤细胞免疫逃逸。本研究探讨了胃癌细胞来源的miRNA-107对MDSCs细胞增殖分化和免疫功能的调控作用，分析了胃癌细胞来源的miRNA-107在MDSCs细胞内的作用靶点，并初步研究了其调控的相关分子机制。　　本研究包括四部分：第一部分：胃癌状态下MDSCs增殖分化和免疫功能的异常变化；第二部分：外源性miRNA-107在MDSCs内靶基因预测及验证；第三部分：胃癌细胞来源的miRNA-107对人MDSCs的调控作用；第四部分：胃癌细胞来源的miRNA-107对小鼠MDSCs的调控作用。　　第一部分 胃癌状态下MDSCs增殖分化和免疫功能的异常变化　　方法：　　1.采集20例术前胃腺癌患者和20例年龄相一致的健康志愿者外周血样品。另外采集6例胃腺癌患者的癌组织和癌旁组织，并将胃癌组织、癌旁组织制成单细胞悬液（入组患者均未经放化疗）。　　2.采用磁珠法从胃癌组织或癌旁组织单细胞悬液及外周血中分选出HLA-DR阴性（HLA-DRneg）细胞。　　3.采用BD FCSCantoTMⅡ型流式细胞仪对HLA-DRneg细胞中的MDSCs进行免疫分型，随后观察MDSCs亚群细胞内精氨酸酶1(arginase1,ARG1)蛋白的表达情况。　　结果：　　1.经流式细胞仪鉴定，磁珠法分选出的HLA-DRneg细胞纯度大于95%。　　2.胃癌患者外周血中HLA-DR-CD33+ARG1+MDSCs、HLA-DR-CD11b+ARG1+MDSCs和HLA-DR-CD14+ARG1+MDSCs细胞亚群与健康人相比数量和频次都显著升高(P＜0.05)。其中HLA-DR-CD33+ARG1+MDSCs亚群所占比例最高（≥90%），与其他亚群间存在显著性差异(P＜0.05)。对HLA-DR-CD33+ARG1+MDSCs进一步免疫分型后发现，HLA-DR-CD33+CD14-CD15-ARG1+MDSCs细胞亚群所占比例最高（≥90%）与其他亚群间存在显著性差异(P＜0.05)。　　3.胃癌组织中HLA-DR-CD33+ARG1+MDSCs、HLA-DR-CD11b+ARG1+MDSCs和HLA-DR-CD14+ARG1+MDSCs与癌旁组织相比数量和频次都显著升高(P＜0.05)，三组亚群细胞间无显著性差异（P＞0.05）。　　第二部分 miRNA-107在MDSCs内靶基因的预测及验证　　方法：　　1.以TargetScan、PicTar和miRanda三种软件系统预测miRNA-107的靶基因。　　2.构建h-DICER1-3UTR和h-PTEN-3UTR荧光报告质粒，并和miRNA-107类似物（miRNA-107mimics）共转染293T细胞，采用双荧光素酶检测试剂盒，观察报告载体的荧光强度，验证miRNA-107的靶基因。　　结果：　　1.h-DICER1mRNA-3UTR和h-PTENmRNA-3UTR序列中存在可与miRNA-107的种子序列互补的序列，h-DICER1mRNA-3UTR中有6个互补序列，h-PTENmRNA-3UTR中有2个互补序列。　　2.293T细胞经h-DICER1-3UTR荧光报告质粒和miRNA-107mimics共转染后，野生组双荧光素酶比值显著低于突变组和对照组。经h-PTEN-3UTR荧光报告质粒和miRNA-107mimics共转染后，野生组双荧光素酶比值显著低于突变组和对照组。　　第三部分 胃癌细胞来源的miRNA-107对人MDSCs的调控作用　　方法：　　1.提取MGC-803、BGC-823、SGC-7901和293T细胞株培养液中的外泌体。采用JEM-1400透射电子显微镜观察外泌体形态；采用Western blot法鉴定外泌体标志性抗体；后采用BCA蛋白定量测定法对外泌体进行定量。　　2.采用qRT-PCR法检测MGC-803、BGC-823、SGC-7901和293T细胞内及其外泌体内的miRNA-107的相对表达量。　　3.荧光显微镜体外观察miRNA-107-Cy3通过外泌体在胃癌细胞和HLA-DR-CD33+MDSCs间的传递。采用qRT-PCR法检测HLA-DR-CD33+MDSCs内miRNA-107和pre-miRNA-107的相对表达量。　　结果：　　1.从细胞株的培养液中提取的外泌体，在透射电子显微镜下观察，其直径均为30～100nm，BCA法检测外泌体蛋白浓度为5～10μg/μl，Western blot法检测到外泌体均表达CD9和CD63分子标志物。　　2.MGC-803、BGC-823、SGC-7901细胞株内的miRNA-107的相对表达量是293T细胞株的2～3倍(P＜0.05)。同时三种细胞株来源的外泌体内miRNA-107的相对表达量是293T细胞株的3～5倍(P＜0.05)。　　3.荧光显微镜可观察到HLA-DR-CD33+MDSCs中Cy3红色荧光，同时HLA-DR-CD33+MDSCs内miRNA-107相对表达量显著升高(P＜0.01)，而pre-miRNA-107相对表达量无显著性变化(P＞0.05)；说明HLA-DR-CD33+MDSCs内高表达的miRNA-107很可能来源于外泌体所携带的外源性miRNA-107。　　第四部分 胃癌细胞来源的miRNA-107对小鼠MDSCs的调控作用　　方法：　　1.用miRNA-107mimics-Cy3转染SGC-7901细胞；提取转染后SGC-7901细胞培养液中外泌体；将提取的外泌体从尾部静脉注射给小鼠，72hr后采集小鼠尾部静脉血；采用磁珠法从小鼠静脉血中分选出CD11b+Gr1+/highMDSCs；在荧光显微镜下观察小鼠CD11b+Gr1+/highMDSCs内出现的Cy3荧光染料的红色；　　2.将SGC-7901细胞分泌的外泌体、胃癌患者血清中提取的外泌体和转染了miRNA-107inhibitors的SGC-7901细胞分泌的外泌体，从尾部静脉分别注射给小鼠，1次/2天，20μg/1次，共7次，72hr后从小鼠尾部采集静脉血；　　3.流式荧光抗体Anti-Gr-1-FITC和Anti-CD11b-PE标记小鼠静脉血有核细胞，后以流式细胞仪计数小鼠静脉血CD11b+Gr1+/highMDSCs和CD11b+Gr1-/low MDSCs数量。　　结果：　　1.经富含miRNA-107mimics-Cy3外泌体7次注射后，在荧光显微镜下可看到小鼠CD11b+Gr1+/highMDSCs内出现的Cy3荧光染料的红色；　　2.经不同来源的外泌体7次注射后，与对照组相比小鼠外周血CD11b+Gr1+/highMDSCs均有不同程度的聚集扩增，各组CD11b+Gr1+/highMDSCs频次依次是，胃癌患者血清外泌体组63.5%(P＜0.05)，SGC-7901细胞外泌体组46.6%(P＜0.05)，293T外泌体组36.6%(P＞0.05)，健康人血清外泌体组（对照组）31.2%。　　3.与缺乏miRNA-107的外泌体组相比，胃癌细胞外泌体组和胃癌患者血清外泌体组小鼠外周血CD11b+Gr1+/highMDSCs中DICER1/PTEN mRNA和DICER1/PTEN蛋白表达水平均有显著降低(P＜0.05)，ARG1/NOS2mRNA和ARG1/NOS2蛋白表达水平均有显著升高(P＜0.05)。　　结论：　　1.胃癌状态下人体外周血和胃癌组织中出现HLA-DR-CD33+ARG1+MDSCs、HLA-DR-CD11b+ARG1+MDSCs和HLA-DR-CD14+ARG1+MDSCs亚群细胞聚集扩增，且免疫抑制功能显著增强。　　2.胃癌细胞来源的miRNA-107可通过外泌体有效传递给MDSCs，并通过靶向3UTRs转录后调控MDSCs内DICER1和PTEN基因表达，诱导HLA-DR-CD33+MDSCs和HLA-DR-CD11b+MDSCs亚群细胞增殖，并可增强其免疫抑制功能。　　3.胃癌细胞来源的miRNA-107可在体内诱导小鼠CD11b+Gr1+/highMDSCs聚集扩增，并可增强其免疫抑制功能。