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目的:分析糖酵解相关基因PFKFB3、PKLR、HK3、LDHB、LDHC启动子甲基化水平在非小细胞肺癌（NSCLC）组织、癌旁组织和远端组织的差异,并探讨这种差异作为NSCLC诊断和预后标志物的可能性。方法:收集105位NSCLC患者癌组织及其配对非癌组织样本,采用q MSP（quantitative methylation specific polymerase chain reaction,定量甲基化特异性聚合酶链反应）方法,分析糖代谢相关基因PFKFB3、PKLR、HK3、LDHB、LDHC启动子的甲基化水平在NSCLC配对的癌组织、癌旁组织和远端组织间差异,筛选阳性基因;随后在细胞水平上,通过5’-aza-deoxycytidine（5’-Aza）处理、双荧光素酶实验等进一步确证这些启动子的功能;同时,结合线上数据和实验数据,综合分析相关基因启动子甲基化位点的临床诊断及预后价值。结果:1、对多个糖酵解相关基因进行甲基化引物检测后,确定了5个可进行肺癌组织筛查的目标基因:PFKFB3、PKLR、HK3、LDHB、LDHC。2、采用qMSP法测定了5个基因的启动子甲基化水平,发现2个基因（LDHC、HK3）的启动子甲基化水平在配对的癌组织、癌旁组织和远端组织间有统计学差异。进一步分析发现LDHC的甲基化水平对肺癌具有诊断意义。LDHC在肿瘤组织的甲基化水平低于相邻的癌旁组织（PMR中位数:40.84%vs.49.89%,P=0.005）,且明显低于远端癌旁组织（PMR中位数:40.84%vs.54.51%,P=0.0004）。对临床病例资料进行进一步分析发现,除较年轻组（age≦60）,病灶位置在右侧组和未吸烟组外,各亚组LDHC的甲基化水平在癌组织和远端癌旁组织中均有差异性（all P<0.05）,HK3甲基化水平在肺腺癌组织与相邻的癌旁组织无显著差别（PMR中位数:29.34%vs.31.89%,P=0.131）,但低于远端癌旁组织（PMR中位数:29.34%vs.40.79%,P=0.016）,在其余各临床分组,无显著意义。3、在细胞水平上,采用DNA去甲基化试剂5’-Aza处理A549、H1299两种肺癌细胞和HB2B人支气管上皮细胞,结果显示,去甲基化处理后,两个基因m RNA表达发生不同程度上调,LDHC（A549:Fold change（FC）=2.553,P=0.0001;H1299:Fold change（FC）=1.290,P=0.0068;HB2B:Fold change（FC）=1.737,P=0.0019）;HK3（A549:Fold change（FC）=7.934,P=0.0031;H1299:Fold change（FC）=2.71,P=0.0015;HB2B:Fold change（FC）=2.768,P=0.0005）,说明LDHC和HK3基因表达受到启动子甲基化调控;双荧光素酶实验用于验证我们检测的两个基因的启动子片段的转录活性,结果显示两个启动子片段都可显著提高报告基因转录水平,LDHC（FC=7.19,P<0.0001）,HK3（FC=1.570,P=0.011）。我们随后对启动子报告质粒进行甲基化修饰,发现甲基化可以显著降低LDHC和HK3检测片段激活报告基因表达的能力,LDHC（FC=8.89,P<0.0001）,HK3（FC=1.570,P=0.011）。4、通过线上数据库对LDHC、HK3表达与启动子甲基化关系分析的结果显示,LDHC、HK3在NSCLC癌组织中甲基化程度更低（P<0.01）,且LDHC和HK3的表达均与Cp G岛和启动子区域的甲基化呈负相关关系。5、通过绘制ROC曲线,以曲线下面积（AUC）评估LDHC、HK3甲基化对NCSLC的诊断能力。结果表明,LDHC低甲基化对于非小细胞肺癌中肺鳞癌患者（AUC=0.768,P=0.041,sensitivity=87.5%,specificity=71.4%）以及吸烟患者（AUC=0.707,P=0.017,sensitivity=84.6%,specificity=51.6%）具有诊断意义,HK3甲基化对非小细胞肺癌患者无诊断意义。利用TCGA数据库收集LDHC启动子区域相关Cp G位点（chr11:18412808,Human GRCh37/hg19）的临床数据并进行大规模分析研究,数据分析表明,在LDHC各Cp G位点甲基化对于非小细胞肺癌患者不具有预后意义,分析HK3启动子区域相关Cp G位点对非小细胞肺癌的预后意义,结果显示cg17393572甲基化对肺腺癌有预后意义（HR=1.434,P=0.027）,cg29312072（HR=0.646,P=0.034）、cg06783121（HR=0.618,P=0.013）甲基化水平高的肺鳞癌患者具有更长生存期。6、我们利用TCGA数据库来确定LDHC、HK3潜在的生物功能。根据LDHC、HK3的中位表达情况,将566例LUAD和551例LUSC样本分为高表达组和低表达组。使用GSEA软件进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书）通路、GO（Gene ontology,基因本体）富集分析,分析结果显示,结果显示LDHC及其相关基因主要富集在ATP生成、细胞外基质形成、细胞周期调控、调节脂肪代谢等过程,HK3及其相关基因主要参与炎症反应和免疫应答等过程。结论:LDHC和HK3的启动子的甲基化水平在肺癌组织、癌旁组织和远端癌旁组织样品中存在差异,其启动子甲基化可以调控基因表达,并可能作为非小细胞肺癌诊断的生物标志物。