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猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一，现在在我国特别是农村散养户普遍存在，造成一定经济损失。动物生前感染沙门氏菌或其产品受到污染，可使人发生食物中毒，因此该病原在公共卫生上也具有重要意义。疫苗接种是控制猪霍乱的最适宜手段。猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株，虽具有较好的免疫原性，但具有一定的残余毒力，遗传背景不清，且存在毒力返强的风险。 粘膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的主要方向。沙门氏菌作为疫苗载体已受到医学与兽医学的广泛重视，其主要优点包括沙门氏菌可以经粘膜途径免疫(口服或鼻内)，操作方便，对接种对象刺激小。此外，沙门氏菌为胞内侵袭细菌，能有效呈递抗原，激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应，并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。但目前所构建的沙门氏菌载体多为鼠伤寒沙门氏菌。以猪霍乱沙门氏菌为载体的报道很少。而猪水肿病(Edema disease of swine，ED)是由某些血清型的E．coli引起的，主要发生在断乳后1—2周的仔猪，是危害断奶仔猪较严重的疾病之一。SLT—Ⅱv毒素是致水肿病的主要致病因子，由1个A亚基和5个B亚基共同组成的聚合体。A亚基为毒素的毒力部分，B亚单位决定毒素的特异性，也是毒素的主要免疫原性部分。 基于以上考虑，本研究旨在研制更加安全的猪霍乱沙门氏菌弱毒株，并将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体。以C500为亲本菌，在基因组上缺失编码cAMP受体蛋白的crp(cAMP receptor protein)基因，以降低C500毒力，消除毒力返强的风险。进一步缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶的asd(aspartate beta-semialdehyde)基因，构建asd平衡致死系统，用于高效表达外源基因，初步应用该载体表达了绿荧光蛋白基因(Green fluorescence protein，gfp)和致水肿大肠杆菌水肿毒素B亚基(Shiga-like toxin type Ⅱ variant B，SLT-ⅡvB)，并进行了小鼠免疫试验，为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗奠定基础。主要研究内容包括： 1．crp、asd基因的克隆与重组自杀性质粒的构建 参照GenBank中鼠伤寒沙门氏菌LT2株crp及asd序列，以C500基因组为模板扩增并克隆crp与asd基因。测序及序列比对分析证实，两基因与已发表的其它3株沙门氏菌crp、asd基因全序列高度同源。从C500基因组中扩增crp及asd上下游片断，连接到自杀性质粒pRE112上，分别构建了缺失320bp的crp基因缺失320bp，插入gfp的crp缺失，以及缺失1408bp的asd基因缺失1408bp，并携带蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp和pREasd。 2．接合转移与C500crp~-、C500crp~-／gfp~+、C500crp~-／asd~-、C500crp~-／gfp~+／asd~-、C500asd~-缺失株的筛选鉴定