第一部分 GDM宫内环境改变对子代学习记忆能力的影响目的:建立GDM模型,探究GDM宫内环境改变对子代学习记忆能力的影响。方法:将怀孕的SD大鼠随机分为对照组和GDM组,其中GDM组在孕5天尾静脉注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),对照组在孕5天尾静脉注射柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液;所有孕鼠于孕13、16和19天分别称重1次。于孕0、7和14天基于ELISA实验进行孕鼠血糖及血胰岛素水平检测。分娩后检测出生时子代羊水中的促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)值,判定GDM宫内环境导致胎儿缺氧的程度。将两组子鼠分别在8周龄和1岁龄进行Morris水迷宫试验,利用Morris水迷宫模型检测GDM对子代空间学习记忆能力的影响。结果:1.孕鼠在孕6天和13天晚8:00后禁食,于孕7天和孕14天上午8:00～9:00尾尖采血测空腹血糖,孕7天血糖较孕前升高20%以上且≤16.65 mmol/L(达到轻度高血糖标准者)定义为造模成功,纳入GDM组;2.与对照组相比,GDM组孕13、16、19天的体重(Body weight)显著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.01);孕 7、14 天空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)及空腹胰岛素(Fasting insulin,FINS)均显著升高(P<0.01,P<0.01;P<0.01,P<0.01);GDM组同胎生仔数及子鼠出生体重较对照组显著降低(P<0.01,P<0.01),而GDM组羊水中的EPO含量显著高于对照组(P<0.01)。3.Morris水迷宫试验中,GDM子代大鼠8周龄组总体表现显著弱于健康对照组,在逃避潜伏期的时长和游泳距离均长于对照组(P均<0.01);而在空间探索期内经过平台原位置的次数和目标象限停留的时间均显著少于对照组(P<0.01,P<0.05);当子代年龄增长至1周岁时,再次进行该实验,发现两组上述四项指标均无显著差异(P均>0.05)。结论:本实验成功建立GDM子代模型,通过Morris水迷宫实验发现GDM宫内环境在子代8周龄时对空间学习记忆能力产生不良影响,即GDM组子代在空间学习记忆能力方面表现明显不如正常对照组子代,但这种差异在子代1周岁时基本得到改善。第二部分GDM宫内环境影响子代学习记忆能力的关键基因目的:筛选并验证GDM宫内环境影响子代学习记忆能力的关键基因。方法:按照第一部分研究方案建立GDM和对照组子代大鼠模型,提取GDM与正常妊娠子代大鼠海马组织的全基因组DNA,制备MeDIP-seq文库,进行全基因组测序。获得原始数据后筛选出高质量数据。使用KOBAS软件将差异序列定位到基因元件上。采用BOWTIE软件将所得序列与参考基因组进行比对,将可比对的序列信息使用MACS软件识别单个样本的甲基化DNA免疫共沉淀(Methylated DNA immunoprecipitation,MeDIP)峰进行差异甲基化基因分析。筛选出候选甲基化特异性关键基因,并进行甲基化特异性候选基因的MSP(Methylation specific PCR),同时行实时荧光定量PCR反应扩增和Western Blot验证。将原代海马神经元细胞分离培养,利用5-杂氮脱氧胞苷抑制DNA甲基化再提取蛋白,用Western Blot法检测关键基因的蛋白表达水平,探究甲基化对关键基因表达情况的抑制作用。结果:1.与对照组相比,GDM组中特异性差异甲基化基因(Specific-difference methylation genes,DMG)为256个,其中180个基因发生了低甲基化,76个基因发生了高甲基化。通过测序结果和文献检索,从中筛选出PTPRT、PP2BA、SLC2A1、PPP1CA、ESR2五个基因作为GDM子代海马组织中甲基化差异性基因候选关键基因。2.甲基化特异性PCR的结果显示,PTPRT基因在对照组的5个样品中均扩增出非甲基化条带,而在GDM组中,均扩增出甲基化条带,PTPRT基因的甲基化水平在五种关键基因中最为显著。3.实时荧光定量PCR结果显示,GDM组五种候选关键基因PTPRT、PP2BA、SLC2A1、PPP1CA、ESR2的转录水平均低于对照组(P均<0.01),但PTPRT的转录水平降低最为显著。4.在GDM组五种候选关键基因PTPRT、PP2BA、SLC2A1、PPP1CA、ESR2的蛋白表达量中,PTPRT的表达水平明显低于对照组。5.GDM组原代细胞中PTPRT表达受到抑制;利用5-杂氮脱氧胞苷抑制DNA甲基化,可见GDM组原代细胞中的PTPRT表达水平得到部分恢复。结论:GDM子鼠脑组织中存在特异性差异甲基化基因,PTPRT基因与GDM组甲基化有较好的相关性。PTPRT基因是否与GDM大鼠子代学习记忆能力有关有待进一步实验证实。第三部分 PTPRT基因对大鼠海马神经元细胞周期及凋亡的影响和分子机制研究目的:探究PTPRT基因对大鼠海马神经元细胞周期及凋亡的影响和分子机制。方法:设计上下游特异性扩增引物,同时引入酶切位点,采用PCR技术调取目的基因CDS区分别构建过表达质粒载体和干扰质粒载体,并进行包装与浓缩纯化,使其转染大鼠海马神经元细胞,将实验对象分为4组,分别为(1)过表达对照组(Vector组):(2)过表达PTPRT组(EGFP-PTPRT组):(3)敲减对照组(siNC):(4)敲减PTPRT组(PTPRT-siRNA 组)。分别利用 mRNA qRT-PCR 检测 mRNA相对表达量,通过Western Blot检测蛋白表达水平,通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况,从而观察各组PTPRT基因表达情况及对大鼠海马神经元细胞周期及凋亡的影响和分子机制。结果:1.Western Blot结果显示敲减PTPRT组细胞分裂S期标志性蛋白CycinA的含量明显低于敲减对照组,过表达PTPRT组Cyclin A的含量则较过表达对照组稍高。2.流式细胞分析发现,PTPRT过表达组处于细胞分裂期(S期)的细胞较过表达对照组(Vector组)明显增多,敲减PTPRT组处于S期细胞明显低于敲减对照组。3.mRNA qRT-PCR检测结果显示,EGFP-PTPRT组中大鼠海马神经元细胞中的凋亡拮抗蛋白Bcl-2的相对mRNA表达量显著高于Vector组(1.30±0.09 vs 1.00±0.04,P<0.01),而凋亡相关蛋白BAX的相对mRNA表达量显著低于Vector组(0.69±0.09 vsl.00±0.02,P<0.01)。PTPRT-siRNA 组大鼠海马神经元细胞中的Bcl-2 相对 mRNA 表达量显著低于 siNC 组(0.64±0.08 vs 0.98±0.06,P<0.01),BAX 的相对 mRNA 表达量显著高于 siNC 组(1.29±0.08vs0.98±0.04,P<0.01)。4.通过Westem Blot进行凋亡相关蛋白表达水平分析发现,PTPRT-siRNA组的BCL-2基因的蛋白表达水平显著低于包括siNC对照组在内的其余三组;而促凋亡蛋白 BAX,Cleaved-Caspase-3 和 Cleaved-Caspase-9 表达量高于其余三组。PTPRT过表达组则与之相反。5.PTPRT过表达(EGFP-PTPRT组)能促进STXBP1及Syntaxin1的结合,使后两者表达水平上升;敲降PTPRT(PTPRT-siRNA组)则抑制了 和STXBP1及Syntaxin1的结合,使后两者表达水平下降。结论:过表达PTPRT基因可提高大鼠海马神经元中处于细胞分裂S期细胞的比例,拮抗对大鼠神经元细胞凋亡,增加STXBP1及Syntaxin1表达水平。相反,敲减PTPRT基因能降低大鼠海马神经元中处于细胞分裂S期细胞的比例,促进大鼠神经元细胞凋亡,降低STXBP1及Syntaxin1表达水平。第四部分 PTPRT基因对GDM子代学习记忆能力作用研究目的:探究PTPRT基因对GDM子代学习记忆能力的作用。方法:构建连接PTPRT基因的病毒质粒载体,进行大鼠侧脑室插管手术,待其清醒后恢复5-7天后进行Morris水迷宫试验。水迷宫试验前将子代大鼠分为4组进行侧脑室药物注射,4组名称和注射药物分别为(1)对照组:正常子代大鼠,侧脑室注射人工脑脊液;(2)GDM模型组:GDM子代大鼠,侧脑室注射人工脑脊液;(3)慢病毒对照组:GDM子代大鼠,侧脑室注射空载质粒;(4)慢病毒过表达PTPRT组:GDM子代大鼠,侧脑室注射连接有PPTPRT基因的慢病毒质粒。记录Morris水迷宫试验相应指标,借此探索PTPRT基因对GDM子代大鼠学习能力的影响,待实验结束后处死大鼠取出其脑组织,并通过Western Blot验证各组子代大鼠PTPRT及其下游Syntaxin 1,STXBP1蛋白表达情况。结果:1、GDM组相比对照组在D1、D2、D3、D4天定向导航试验的逃避潜伏期明显延长(P<0.0001,P<0.0001,P<0.0001,P<0.001);过表达组(GDM+PTRRT)D1、D2、D3天定向导航试验显著小于GDM+Vector组时长,但在D4天时与GDM+Vector组时长相当(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P>0.05);GDM 组相比对照组在 D1、D2、D3、D4天定向导航试验的游泳距离明显延长(P<0.01,P<0.0001,P<0.0001,P<0.01);过表达组(GDM+PTRRT)组在D1、D2、D3天定向导航试验的游泳距离显著小于GDM+Vector组时长,但在D4天时与GDM+Vector组游泳距离无显著差异(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P>0.05)。2、Morris水迷宫空间探索实验中,GDM子代大鼠组进入目标区域的次数显著低于对照组(P<0.0001);而GDM+PTPRT过表达组进入目标区域的次数明显高于过表达对照组(P<0.05);GDM子代大鼠组目标象限的停留时间组比对照组子代明显缩短(P<0.0001);GDM+PTPRT过表达组停留在目标象限的时间较GDM组则显著延长(P<0.05)。3、各组PTPRT表达水平均符合其典型Western Blot表现。GDM组PTPRT、Syntaxin 1和STXBP1表达含量较对照组下降;而在过表达PTPRT载体组中,可以观察到Syntaxin 1和STXBP1含量略高于GDM组。结论:PTPRT基因的甲基化与GDM子代大鼠学习记忆能力下降有关,PTPRT基因的过表达能部分改善GDM子代大鼠的学习记忆能力,可能与PTPRT基因过表达使Syntaxin 1和STXBP1上调有关,涉及的具体机制有待进一步研究。总结:本研究从基因、转录、蛋白及行为实验多层次多维度地揭示了 GDM子代大鼠海马神经元中PTPRT基因的甲基化与子代空间学习能力下降的关系,并初步验证过表达PTPRT基因可部分改善GDM子代大鼠的空间学习记忆能力。为进一步揭示GDM的发病机制和GDM及相关并发症的预防及治疗奠定了一定的理论基础。