背景:癌症化学预防是指利用药物降低癌症发生风险,延缓癌症发展及防止癌症复发,是一种有效的抗癌策略。目前癌症预防药物的研究主要是基于动物实验以及流行病学实验开展的,实验成本高且实验周期长。而基于细胞平台的实验则能直接反应药物在细胞上的作用,能实现高通量筛选,缩短实验周期。但目前适用于研究癌症预防药物的细胞模型尚不成熟,Bhas 42细胞体外转化实验是一种经典的致癌物检测技术,本文希望通过采用稳定的致癌物诱导细胞发生转化,并在此基础上观察药物对转化结果的逆转作用,开发适用于研究癌症预防药物的细胞模型。中药复方百合固金方为治肺肾阴虚之剂,有养阴清热、凉血止血、润肺止咳之功效,方中药味所含化学成分具有癌症预防相关活性报道,具有研究肺癌化学预防作用的潜在价值。目的:本文希望以香烟烟气冷凝物(CSC)诱导Bhas42细胞发生恶性转化实验为基础,建立适宜于筛选和研究癌症预防药物的细胞模型,并以此模型为基础,考察百合固金方及其中药味的癌症化学预防作用。方法:1.CSC的制备与一致性表征:收集7个品牌市售混合型香烟,采用剑桥滤膜吸附法富集香烟烟气冷凝物。将富集后的剑桥滤膜溶于溶剂中超声萃取,基于GC-MS平台和指纹图谱技术,对CSC成分进行定性分析,并评价其一致性。2.CSC诱导细胞恶性转化模型的建立及其分子机制的研究:首先利用CCK-8法考察不同浓度的CSC对细胞活力的影响,确定CSC的安全剂量。其次通过转化灶形成实验考察CSC的诱导细胞发生转化的能力,即将Bhas 42细胞接种到六孔板中,用CSC诱导细胞发生转化,培养至第21天,计算转化灶的数量。最后将细胞转化灶扩增,形成转化的Bhas42细胞系(T-Bhas42),采用ELISA法测定细胞转化前后α-SMA蛋白的表达量变化,采用RT-PCR法测定细胞转化前后TGF-β1、Smad4、α-SMA基因的表达量变化,采用流式细胞法检测细胞转化前后周期的分布情况,探究细胞的转化机制,为癌症化学预防药物的机制研究奠定基础。3.细胞转化模型用于筛选癌症预防药物的可行性研究:基于上述细胞转化模型,用不同浓度的水杨酸、姜黄素、亚硒酸钠以及阿魏酸四种有效单体对转化过程进行干预,计算转化灶的数量,考察四种具有癌症化学预防作用的有效单体对细胞转化灶形成的影响。4.百合固金方及其中药味的癌症预防作用的考察:参考2015版《中国药典》中百合固金口服液的提取工艺,采用水提醇沉的方法制备全方及方中各药味提取物,考察各其抑制细胞转化灶形成的能力,同时对比熟地黄+麦冬、熟地黄+当归、当归+麦冬、熟地黄+当归+白芍(养血滋阴类)、川贝母+桔梗+甘草(止咳化痰类)、百合+生地黄+麦冬+玄参(养阴清热类)方中药味配伍应用抑制转化灶形成的能力。采用Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,通过考察脏器指数、肿瘤发生率和肿瘤体积,验证细胞试验所筛选出的药味及药味配伍在整体动物水平上的癌症预防作用。结果:1.采用剑桥滤膜吸附法制备CSC工艺稳定,得率为8.95±1.78μg·支-1,GC-MS结果显示本法制得的CSC成分复杂,多为环烃类结构,以尼古丁和三醋酸甘油酯为主,峰面积占比分别为64.69%和22.81%。指纹图谱相似度分析结果显示且不同品牌间烟气冷凝物的相似度值均不低于0.98,说明所制备的CSC一致性良好,可用于诱导细胞转化。2.用25 μg/mL的CSC对细胞造模后,可见有明显且稳定的恶性转化灶形成(10.5±2.5个·孔-1),与对照组(1.5±0.5个·孔-1)相比具有显著性差异,证明模型建立成功。ELISA结果显示转化后的细胞α-SMA表达量与正常的Bhas 42细胞相比显著下降(P<0.05);RT-PCR结果显示,与Bhas42细胞相比,T-Bhas42细胞的TGF-β1、Smad4以及α-SMA三个基因的相对表达量均有不同程度的下降,且差异具有显著性(P<0.05);流式检测细胞周期结果表明,与Bhas 42细胞相比,T-Bhas 42细胞处于S期的细胞比例增加,处于G0/G1期细胞比例减少(P<0.05)。证明CSC可能通过调节TGF-β通路诱导Bhas 42细胞发生转化,形成具有更强生长和增殖能力的恶性转化细胞。3.有效单体干预实验显示,不同剂量的水杨酸、阿魏酸、姜黄素和亚硒酸钠均能不同程度地抑制恶性转化灶的生成,与模型组相比具有显著性差异,初步证明本文所建立的细胞模型能够体现有效单体的癌症预防作用,具有用于研究癌症预防药物的潜力。4.百合固金方的干预实验显示,熟地和当归单用及联用均可以明显减少细胞转化灶的数量,与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)。小鼠肺癌移植瘤预防实验表明,细胞模型所筛选的熟地和当归均能显著抑制肿瘤的发生与发展,相较百合固金方全方具有更明显的作用趋势,表现出与细胞模型筛选结果的一致性。体现了香烟烟气冷凝物诱导Bhas 42细胞转化模型在筛选癌症预防药物的上的意义。结论:基于CSC诱导Bhas 42细胞转化实验,初步建立了适用于研究癌症预防药物的细胞模型,利用己知有效单体对该模型进行初步评价,模型稳定性和可行性表现良好。基于本细胞模型筛选出了百合固金方中癌症化学预防作用明显的药味及配伍组合,并通过动物实验初步验证了模型筛选结果的可靠性。