论文部分内容阅读
裂解酶为噬菌体感染宿主后期表达释放的一类细胞壁水解酶,通过水解细胞壁肽聚糖而使细菌裂解,并释放出子代噬菌体。噬菌体裂解酶能高效地裂解细菌,使其有望取代传统的抗生素治疗,特别是对多重耐药性致病菌。本文从云南洱源热泉中分离得到一株亚栖热菌噬菌体MMP7（Meiothermus Myoviridae phage 7）,通过透射电镜观察其形态,并对其基因组进行了测序及基因组特征分析;将MMP7裂解酶基因MMPpgh通过PCR扩增、连接、转化后得到表达菌株pET28a-MMPpgh/Rosetta,经诱导表达及纯化后得到重组蛋白裂解酶MMPpgh,并研究其酶学性质。此后通过双层平板和涂布计数法,研究裂解酶MMPpgh对部分大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、多重耐药肺炎克雷伯氏菌和益生菌菌株的杀伤和裂解作用;同时使用扫描电镜（SEM）观察裂解酶MMPpgh对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和亚栖热菌TG07的裂解作用。最后通过建立小鼠外伤感染模型,研究裂解酶MMPpgh在治疗多重耐药金黄色葡萄球菌在外伤感染中的作用。经透射电镜观察表明,噬菌体MMP7是一株典型的肌尾科。基因组测序表明,其为双链DNA病毒,基因组大小为32864 bp,GC含量为63.99%,总共有53个ORFs,其中ORF28为裂解酶基因MMPpgh,大小为630 bp,GC含量为60.32%;同源比对分析表明MMPpgh与来自栖热菌噬菌体的肽聚糖水解酶具有较高同源性,保守结构域表明,MMPpgh属于M23肽酶家族。将裂解酶基因MMPpgh克隆表达后,得到分子量为24.53 KDa的重组蛋白。该裂解酶最适酶活温度为60℃,从30到68℃均有酶活,高于大部分已报道的噬菌体裂解酶的最适作用温度;其在pH7-8时活性最强;金属离子Ca2+,Fe2+存在时导致MMPpgh酶活性降低,而Zn2+,Mg2+对酶有激活作用。在酶浓度为50μg/mL的浓度下,MMPpgh与Kan+青霉素相比对亚栖热菌TG07均有明显的抑菌作用,相对抑菌率高达91.67%;对沙门氏菌CMCC（B）50094、大肠杆菌CMCC（B）44102菌株的致死率达90%,对多重耐药肺炎克雷伯氏菌的致死率高达87%;通过SEM观察表明,裂解酶MMPpgh通过对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌ATCC6538和亚栖热菌TG07的裂解作用而实现其杀菌功能。小鼠外伤感染模型中,裂解酶MMPpgh对多重耐药金黄色葡萄球菌的杀伤达50%,对伤口具有较好的愈合作用。综上所述,裂解酶MMPpgh具有高温催化活性和稳定性。在37℃下,能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。具有相对较广裂解谱,对多重耐药性肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌杀伤作用明显,有望成为新型的抗菌物质。本研究为抗生素的替代技术提供了一个新的思路。