支气管哮喘是常见的呼吸道慢性疾病之一,其发病率在全球范围内呈增加的趋势,已经成为危害人类健康的公共健康问题。气道重塑是哮喘患者肺功能损伤的病理基础,是哮喘症状反复发作的重要原因,也是临床亟需解决的治疗难题。虽然当前全球哮喘防治创议(Global intiative for asthma,GIN A)方案的有效执行,在临床上获得了一定疗效,该方案中的主要药物糖皮质激素、长效β2受体激动剂、白三烯拮抗剂等在减轻气道炎症和缓解哮喘症状方面有效,但对气道重塑的效果微弱,难以在本质上遏制哮喘的发展演变。因此,需要从基因、蛋白、细胞等多层次入手,深入探讨哮喘气道重塑的病理改变机制,探寻控制气道纤维化的关键靶位和调控机制,为开发改善气道结构或逆转气道重塑的药物奠定基础。上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指在一定条件下(如TGF-β1等)上皮细胞失去上皮表型特征转变为成纤维细胞样间质表型的过程,细胞骨架发生改变,运动能力增强,获得间质细胞特征。在EMT转化过程中上皮细胞标志性蛋白如E-钙粘素等表达下降,间质细胞标志性蛋白如N-钙粘素、波形蛋白和α-SMA等表达上调。目前研究表明,EMT间充质转化分为3种类型:1型,主要与胚胎的发育和形成、原肠形成和神经嵴发育等有关;2型,主要与组织创伤后愈合、再生修复等有关;3型,主要与胃肠道等恶性肿瘤细胞的侵袭、转移等有关。目前研究发现EMT可由多种信号通路调控,其中TGF-β信号通路是主要的介导调控通路。人体内多种细胞均可表达TGF-β受体,TGF-β受体有3型,Ⅰ和Ⅱ型受体为跨膜结构,起信号转导作用;Ⅲ型受体不参与信号转导。Ⅰ和Ⅱ型受体具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,能诱导特定信号转导的级联反应。首先TGF-β与Ⅱ型受体结合激活Ⅱ型受体胞浆区的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域,促使Ⅰ型受体胞浆区GS结构域磷酸化使Ⅰ型受体活化,从而启动细胞内信号转导。课题组前期通过构建哮喘气道重塑小鼠模型发现哮喘小鼠肺组织TGF-β1、Smad3表达均增加,推测TGF-β1/Smad信号通路与哮喘EMT间充质转化相关,可能是研究哮喘气道重塑的重要方向。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)是一类短小的非编码单链RNAs,由18-25个核苷酸组成,在生物进化过程具有高度保守性和组织特异性,是基因表达的重要调节因子。miRNAs存在几乎所有的真核生物中,通过与靶基因3’-Untranslated Region(UTR)结合,诱导特定的mRNA降解或抑制翻译,从而调控特定基因的转录和表达。miRNAs可参与多种生物学过程,比如细胞的增殖、分化和应激反应等。基因表达与miRNAs关系复杂,一个miRNA可以调控多个基因,单个基因也可通过多个miRNAs调控,miRNAs与靶基因在多种疾病中形成网络化的调控模式。近年来,miRNAs在肿瘤、免疫学和炎症性疾病方面取得了诸多研究成果,但在哮喘中的作用研究尚处于初始阶段。有研究发现miR-378在支气管哮喘患儿血液和肺组织表达较健康儿童明显增加,体外实验表明miR-378可能通过Ras、MAPK或Ca2+信号途径促进了平滑肌细胞的增殖,增加了其抗凋亡能力,促进了哮喘气道重塑。另外一项研究表明miR-323-3p可能通过下调TGF-β信号通路抑制T细胞产生IL-22,阻断了哮喘病的发生发展。Cheng D等研究发现miR-448通过抑制EMT表型转化来降低非小细胞肺癌的转移和侵袭。有研究发现下调miR-448-5p表达上调NF-kB信号通路活性,导致了 EMT及肿瘤的发生发展。我们课题组前期发现哮喘组小鼠和经TGF-β1干预的人支气管上皮细胞中miR-448-5p表达下降,推测miR-448-5p可能与哮喘气道重塑和纤维化相关。为了研究miR-448-5p发挥作用的分子机制,我们通过生物信息学软件Target Scan 6.2预测结果显示Six1 3’-UTR具有与miR-448-5p的结合位点,推测Six1可能是miR-448-5p的靶基因。同源盒基因Six1基因定位在人染色体14q23,编码由283个氨基酸组成的蛋白质。Six1存在于多种细胞中,在大脑、肾脏、眼睛等多种组织器官分化发育过程中起着至关重要的作用。目前研究表明Six1作为促癌基因具有增强肿瘤细胞侵袭转移的能力,己经成为乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等肿瘤学研究的热点。研究发现生理情况下Six1可以激活下游基因细胞周期蛋白Cyclin A1和Cyclin D1等,保证细胞周期的顺利进行。Six1的过度表达则扰乱了正常生理现象,增加了细胞周期和增殖,促进了组织器官纤维化和过度增殖的发生。目前研究发现在不同肿瘤组织中的Six1的作用靶点不同,在乳腺恶性肿瘤中细胞周期蛋白Cyclin A1是其下游作用靶点,高表达的Six1上调了 Cyclin A1表达,促使细胞增殖、细胞存活、血管生长和DNA修复增加。在横纹肌恶性肿瘤中,高表达的Six1可激活细胞周期蛋白Cyclin A1、细胞周期蛋白Cyclin D1等促进肿瘤侵袭转移。尽管Six1在疾病进程中的作用初露端倪,但其在哮喘中的具体作用及其调控机制却罕见文献报道。我们前期通过动物实验发现哮喘小鼠肺组织Six1表达明显升高,沉默Six1可通过下调NF-kB信号通路有效抑制哮喘模型小鼠气道炎症和气道重塑,表明Six1与哮喘气道重塑密切相关。本研究将通过构建哮喘小鼠气道重塑模型和TGF-β1诱导人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型,揭示miR-448-5p在哮喘气道重塑的作用和功能,阐明miR-448-5p通过调控靶基因Six1抑制人支气管上皮细胞EMT间充质转化和哮喘气道重塑;明确miR-448-5p对TGF-β/Smad信号通路的调节作用和分子机制,有望为今后更有效的防治哮喘气道重塑提供新的分子靶点和理论依据。第一部分TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化模型的构建目的EMT间充质转化是哮喘气道重塑和纤维化的重要机制,本部分研究拟用TGF-β1作用人支气管上皮细胞构建EMT间充质转化模型,为后续研究提供工具。方法1.不同浓度TGF-β1作用于人支气管上皮细胞16HBE。2.倒置显微镜下观察TGF-β1刺激后人支气管上皮细胞形态的变化。3.Western blot检测人支气管上皮细胞EMT间充质转化标志蛋白和气道纤维化相关蛋白表达情况。结果1.倒置显微镜下观察到人支气管上皮细胞经TGF-β1(10ng/ml)干预后细胞丧失原本的鹅卵石状不规则形态,转变为长梭形成纤维细胞样形态。2.人支气管上皮细胞经不同浓度TGF-β1干预后上皮细胞标志物E-钙粘素表达量较对照组均减少(P<0.05),间质细胞标志蛋白α-SMA和波形蛋白表达量均增加(P<0.05),差异具有统计学意义。3.人支气管上皮细胞经TGF-β1(lng/ml、10ng/ml)干预后纤维粘连蛋白、胶原蛋Ⅳ表达量较对照组明显增加(P<0.05),差异均有统计学意义;4.TGF-β1干预人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型中,在TGF-βl干预浓度为10ng/ml时,EMT表型标志物和纤维化相关蛋白改变较为明显。结论筛选发现TGF-β1(10ng/ml)干预人支气管上皮细胞后形态转变为成纤维细胞样长梭形,表型标志物变化较为明显,成功构建EMT间充质转化模型用于后续研究。第二部分miR-448-5p对TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化和气道纤维化的影响目的miR-448-5p被认为是与EMT转化相关的miRNA。本研究将分析miR-448-5p在哮喘气道重塑模型小鼠肺组织和TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型中的表达情况;通过转染miR-448-5p mimic和miR-448-5p inhibitor探讨其对TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT间充质转化和气道纤维化的作用及其可能的分子机制。方法1.构建哮喘气道重塑小鼠模型和TGF-β1诱导人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型;用RT-PCR技术检测miR-448-5p在哮喘小鼠肺组织和TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞中的表达。2.将miR-448-5p mimic、miR-448-5p inhibitor转染入人支气管上皮细胞,给予TGF-β1干预,RT-PCR技术检测细胞中EMT相关标志蛋白的表达情况。3.将miR-448-5p mimic、miR-448-5p inhibitor转染入人支气管上皮细胞,给予TGF-β1干预,RT-PCR技术检测纤维粘连蛋白、胶原蛋白ⅣmRNA的表达情况。4.将miR-448-5p mimic、miR-448-5p inhibitor转染入人支气管上皮细胞,给予TGF-β1干预,Western blot检测细胞中Smad3的表达,分析miR-448-5p发挥作用的可能机制。结果1.本实验成功构建哮喘小鼠气道重塑模型和TGF-β1诱导人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型,RT-PCR检测发现哮喘小鼠肺组织和EMT间充质转化模型中miR-448-5p表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.上调miR-448-5p可增加TGF-β1作用的人支气管上皮细胞E-钙粘素表达,同时波形蛋白表达显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。下调miR-448-5p表达可明显减少TGF-β1作用的人支气管上皮细胞E-钙粘素表达,同时波形蛋白表达明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.上调miR-448-5p组可明显减少TGF-β1诱导的纤维粘连蛋白、胶原蛋白ⅣmRNA表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。下调miR-448-5p组可明显增加TGF-β1诱导的纤维粘连蛋白、胶原蛋白Ⅳ mRNA表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.上调miR-448-5p组细胞磷酸化Smad3表达较单纯TGF-β1处理组表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。下调miR-448-5p组细胞磷酸化Smad3较单纯TGF-β1处理组表达明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论miR-448-5p能够抑制TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT间充质转化和气道纤维化,TGF-β/Smad3信号通路是其可能的作用途径。第三部分miR-448-5p通过调控Six1抑制TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化的研究目的我们通过生物信息学软件Target Scan 6.2预测结果显示Six1 3’-UTR具有与miR-448-5p结合位点,推测Six1可能是miR-448-5p的靶基因。本部分研究将揭示miR-448-5p与Six1的靶向调控关系及Six1对TGF-β1/Smad信号通路的调控作用及相关的分子机制。方法1.生物信息学软件Target Scan 6.2预测miR-448-5p可能的靶基因。Westem blot方法检测转染miR-448-5p mimic、miR-448-5p inhibitor后人支气管上皮细胞后Sixl表达情况。2.构建哮喘气道重塑小鼠模型和TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT间质转化模型,免疫组化和Western blot检测哮喘小鼠肺组织和人支气管上皮细胞中Sixl的表达情况。3.将Sixl干扰质粒转染入人支气管上皮细胞,给予TGF-β1干预,Western blot检测人支气管上皮细胞EMT间充质转化标志蛋白和纤维粘连蛋白的表达情况。4.将Six1高表达质粒和miR-448-5p mimic共转染入人支气管上皮细胞,给予TGF-β1干预,RT-PCR检测人支气管上皮细胞EMT间充质转化标志蛋白和纤维粘连蛋白、胶原蛋白Ⅳ表达情况。5.沉默人支气管上皮细胞Six1的表达,给予TGF-β1干预,Western blot检测了人支气管上皮细胞Smad3的表达。结果1.生物信息学软件Target Scan 6.2预测结果显示Six1 3’-UTR具有与miR-448-5p结合位点,推测Six1可能是miR-448-5p的靶基因。双荧光素酶结果发现Six1 3’-UTR野生型载体共转染miR-448-5p mimic后,与对照组比较荧光素酶的活性显著降低,而突变型载体未见明显变化。Western blot检测发现转染miR-448-5p mimic后人支气管上皮细胞Six1表达情况较单纯TGF-β1诱导组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),而转染miR-448-5p inhibitor后人支气管上皮细胞Six1表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.构建哮喘气道重塑小鼠模型和TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型,免疫组化和Western blot方法检测证实了哮喘组小鼠肺组织Six1表达较对照组显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。人支气管上皮细胞经TGF-β1干预后Six1表达较对照组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Western blot检测发现沉默Six1表达后E-钙粘素表达较单纯用TGF-β1刺激组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),波形蛋白表达显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05);沉默Six1表达后纤维粘连蛋白较仅用TGF-β1刺激组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.RT-PCR发现转染Six1高表达质粒和miR-448-5pmimic组细胞E-钙粘素mRNA表达较仅转染miR-448-5p mimic组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),波形蛋白mRNA表达明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);转染Six1高表达质粒和miR-448-5p mimic组细胞纤维粘连蛋白、胶原蛋白ⅣmRNA表达较仅转染miR-448-5p mimic组显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.将Six1干扰质粒转染入人支气管上皮细胞,结果发现沉默Six1组人支气管上皮细胞经过TGF-β 1作用后磷酸化Smad3表达较仅TGF-β 1干预组细胞明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论miR-448-5p可能通过靶向调控Six1抑制TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化和气道纤维化,为深入探讨miR-448-5p的作用模式提供了理论依据。