背景随着对脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mysenchymal stem cells, HUCMSCs)的研究深入,越来越多的结果证明,]HUCMSCs能够成功分化为神经样细胞,并且在神经系统动物模型中具有很好的修复作用。但其中存在很多问题：HUCMSCs的生物学特性还不甚清楚；向神经元样细胞方向诱导分化,虽然各种方法都可以成功获得神经元样细胞,但诱导效率并不高,并且不能有效的获得单一种类的神经元细胞,这给临床应用造成很大的不便；成功诱导HUCMSCs为神经元样细胞的机制还不清楚,干细胞治疗中枢神经系统疾病还处于动物实验阶段,缺乏临床证据。目的本文从人脐带间充质干细胞的多潜能特性出发,探讨不同方法诱导HUCMSCs向神经样细胞(Neuron-like cells)分化的可行性,为进一步研究HUCMSCs分化机制及在治疗神经系统疾病方面提供理论依据。方法1.细胞的培养和鉴定：HUCMSCs采用低糖DMEM+10%FBS进行培养,当细胞融合达到80-90%时,按照1：2或者1：3的比例进行传代。采用流式细胞仪(Flow cytometry, FCM)对HUCMSCs进行表型鉴定。2.细胞诱导：采用以下三种方法对HUCMSCs进行诱导：①低糖DMEM+10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)+20%胎儿脑组织匀浆(Human fetal brain tissue extracts, HFBTE)②ovine neuronal stem cell culture medium (Beijing huasen biotechnology, co. Ltd.)+20%HFBTE;③低糖DMEM+10%FBS+bFGF+DMSO+insulin+EGF。3.采用免疫荧光、RT-PCR和Western blotting进行神经标志物NSE、GFAP、 β3-tubulir等和神经营养因子BDNF、GDNF、VEGF等鉴定。结果1.FCM鉴定结果显示,HUCMSCs表达CD73、CD90、CD105为阳性(>95%),CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR表达为阴性(<2%)。2.RT-PCR和Western blotting检测结果显示,]HUCMSCs能够表达神经标志物NSE、GFAP和多巴胺神经元转录因Nurr1、Wnt-1和En-1。3. RT-PCR结果发现,HUCMSCs能够表达神经营养因子BDNF、GDNF、VEGF、 LIF、NGF和NT-3。4. Western blotting检测显示,和未诱导干细胞组(对照组)相比,低糖DMEM+10%FBS+20%HFBTE诱导HUCMSCs3天和5天后,神经标志物NSE、GFAP、β3-tubulin、DAT和TH明显上调；免疫荧光(]mmunofluorescence Staining,IF)结果显示,20%脑组织匀浆诱导3天,各个神经标志物阳性率分别是NSE18.32±4.07%,GFAP16.94±7.56%, Nestin14.47±3.20%,LMXlB7.17±3.28%,DBH1.81±1.07%,DAT5.65±0.93%；诱导5天后,阳性率分别为NSE22.08±2.75%,GFAP17.83±5.55%, Nestin23.82±6.05%, LMX1B11.98±2.71%, DBH11.83±2.75%,DAT13.86±5.50%。5. RT-PCR和Western blotting结果显示,bovine neuronal stem cell culture medium+20%HFBTE诱导3天和5天后,HUCMSCs神经标志物(Nestin. NSE、S100B、En-1)和神经营养因子(BDNF、GDNF、VEGF、LIF、NGF和NT-3)明显上调；6.同样,低糖DMEM+10%FBS+bFGF+DMSO+insulin+EGF处理HUCMSCs7天后,HUCMSCs神经标志物(GBX2、GFAP和DAT)和神经营养因子(BDNF、GDNF、 VEGF、LIF、NGF和PNT-3)明显上调。结论低糖DMEM+10%FBS+20%HFBTE、bovine neuronal stem cell culture medium+20%HFBTE和低糖DMEM+10%FBS+bFGF+DMSO+insulin+EGF均能诱导HUCMSCs分化为神经样细胞,为进一步临床试验打下基础。