目的：癫痫(epilepsy)是以脑神经元异常放电引起的慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征,是神经系统常见疾病之一。颞叶癫痫(Temporal Lobe Epilepsy, TLE)占难治性癫痫(refractory epilepsy, RE)患者的60%～70%,是局限性癫痫的代表,主要病理表现为海马、杏仁核、嗅皮层及正中丘脑核团内选择性神经元脱失、胶质细胞增生、苔藓纤维出芽以及特异性突触重塑。近年来应用原位杂交法、免疫组化法及cDNA微阵列等方法研究发现了一些与癫痫相关的异常基因表达,这些基因参与免疫应答、炎症、细胞内信号转导、转录调节因子及细胞周期调控。尽管传统杂交方法在某些研究中成功运用,但是不适合鉴别稀有基因。与传统杂交方法不同,抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, S SH)是一种功能强大的鉴别稀有信息的方法,并且拥有快速、灵敏、高效、假阳性率低和可重复性的特点。本实验应用SSH技术对氯化锂—匹鲁卡品致痫大鼠这一公认的颞叶癫痫大鼠模型的海马组织构建差异表达基因的正向消减cDNA文库,寻找与癫痫发作有关的新的基因片段,以进一步探索颞叶癫痫的发病机制和相关基因的特征。方法：1.建立颞叶癫痫大鼠模型,成年健康雄性Wistar大鼠14只,体质量200～250g,山东大学实验动物中心提供。分为癫痫组8只,对照组6只。癫痫组给予氯化锂127mg/kg腹腔注射,24h后腹腔注射匹鲁卡品30mg/kg,在匹鲁卡品注射前30min给予阿托品1mg/kg腹腔注射,以拮抗外周胆碱能效应。出现癫痫持续状态90min后给予安定10mg/kg腹腔注射终止发作。对照组给予相同剂量的生理盐水腹腔注射。2.提取组织RNA并用于SSH分离差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取个60个白色克隆用菌落PCR法筛选差异基因克隆,并进行测序分析。3.测序结果通过BLAST序列对比工具进行同源性比较,并应用Gene Ontology(GO)对基因进行功能性分类。结果：1.颞叶癫痫大鼠模型：匹鲁卡品致痫后按照Racine大鼠癫痫发作分级标准判定其发作程度,发作达到3-5级的大鼠视为诱导成功,表现为点头、面部肌肉抽搐、肢体阵挛和跌倒等。癫痫组有两只死亡,在实验组中剔除。对照组无死亡2.对鉴定出的基因进行功能分类,发现这些基因与细胞生长、蛋白质转运、细胞内信号转导等有关,推测它们在颞叶癫痫发病机理方面起着重要作用。结论：本实验成功构建了颞叶癫痫大鼠模型海马组织的正向消减cDNA文库,并发现与颞叶癫痫相关的基因。抑制消减杂交技术是一种高效的筛选差异表达基因的方法,为深入研究癫痫发病的分子机制提供了重要线索。目的：癫痫(epilepsy)是以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征的慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征,因为脑病变及放电起源的部位不同,癫痫发作可表现为运动、感觉、意识、精神、行为和自主神经等功能异常。癫痫的诊断主要根据发作史,目击者对发展过程提供可靠的详细描述,及脑电图检测到脑部异常电活动是诊断癫痫的重要依据,特别是在发作性症状间期,可记录到阵发性异常或痫样波等。抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)是一种功能强大的鉴别稀有信息的方法,并且拥有快速、灵敏、高效、假阳性率低和可重复性的特点。本实验应用抑制消减杂交技术对临床上确诊为原发性癫痫的患者的外周血构建差异表达基因的正向消减cDNA文库,分析癫痫的相关基因,寻找与癫痫发作有关的新的基因片段,以进一步探索癫痫的发病机制和相关基因的特征。方法：1.抽取2011年9月～12月至山东大学第二医院门诊就诊并根据病史特征及脑电图、磁共振检查确定为原发性癫痫的患者的外周血3m1,与4℃冰箱保存。2.提取外周血RNA并用于SSH分离差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取个50个阳性克隆进行测序分析。3.测序结果通过BLAST序列对比工具进行同源性比较,并应用Gene Ontology(GO)对基因进行功能性分类。结果：1.在癫痫患者外周血中获得4个差异表达基因,与人类己知基因片段高度同源。2.对鉴定出的基因进行功能分类,发现这些基因与细胞凋亡调节,神经生长因子生成,细胞骨架,细胞粘附和信号传导等有关,推测它们在癫痫发病机理方面起着重要作用。结论：本实验成功构建了原发性癫痫患者外周血的正向消减cDNA文库,并发现与癫痫相关的基因。抑制消减杂交技术是一种高效的筛选差异表达基因的方法,为深入研究癫痫发病的分子机制提供了重要线索。