论文部分内容阅读
目的:通过观察DKD大鼠早、中、晚期线粒体超微结构、线粒体功能的变化,探讨不同病程阶段通络益肾方对DKD大鼠线粒体功能的干预效果及其调节机制,为此方的临床应用提供充分的实验依据。方法:选用SPF级健康雄性SD大鼠260只,普通饲料适应性喂养1周,检测血糖和尿蛋白,均为阴性者用于实验。随机抽取50只作为正常对照组(No-treatrment group,NG组),其余210只大鼠均为造模组。造模组大鼠采用右肾切除+腹腔注射链脲佐菌素(STZ)+高脂饮食建立大鼠DKD模型。当24 h尿蛋白定量≥30 mg即DKD大鼠模型制备成功。以建模成功作为实验的起始,记为0周。正常对照组予以假手术。将造模成功的DKD大鼠按随机数字表法分为模型组(Model control group,MG组)61只、缬沙坦治疗组(Positive control group,PG组)47只、通络益肾方早期治疗组(Traditional medicine early-treatrment group,TEG组)47只、通络益肾方中期治疗组(Traditional medicine middle-treatrment group,TMG组:9周开始灌胃给药)23只、通络益肾方晚期治疗组(Traditional medicine late-treatrment Group,TLG组:22周开始灌胃给药)23只。给药共持续26周。NG、MG、PG、TEG组分别于第9周末、22周末各处死10只大鼠。余大鼠在26周末处死。观察大鼠一般状态,检测空腹血糖,24h尿蛋白定量,肾功能(BUN、Scr);透射电镜观察肾皮质线粒体超微结构;Real-time PCR检测PGC-1α、TFAM m RNA及线粒体DNA拷贝数,荧光素酶法检测肾皮质ATP含量,流式细胞术结合DCHF-DA染色检测细胞内ROS活性,流式细胞术结合JC-10染色检测肾小球线粒体膜电位。结果:1、通络益肾方对糖尿病肾病大鼠的精神状态、毛色、活动等具有明显的改善作用;能降低大鼠空腹血糖、24 h尿蛋白定量以及BUN、Scr,降低尿蛋白,保护肾脏功能,早期干预效果优于中期、晚期。2、足细胞线粒体超微结构透射电镜显示:NG组各时间点肾小球基底膜正常,足细胞线粒体呈圆形、卵圆形或杆状,形态饱满,线粒体嵴结构清晰排列整齐。MG组肾小球基底膜明显不均匀增厚,在9周末足细胞内线粒体出现重度肿胀,基质稀薄,22周末、26周末线粒体重度损伤,表现为线粒体肿胀、破裂,基质空化,嵴紊乱、减少或消失。与MG组比较,TEG组与PG组线粒体损伤程度较轻。26周末时,与TEG组比较,TMG组、TLG组线粒体损伤程度较重。结果表明,DKD大鼠经通络益肾方干预后足细胞线粒体损伤程度减轻,早期干预效果优于中期、晚期。3、肾皮质线粒体生物合成相关基因PGC-1、TFAM m RNA表达检测结果表明:PGC-1α、TFAM m RNA随时间呈依赖性递减,DKD大鼠经通络益肾方干预后肾皮质线粒体PGC-1αm RNA、TFAM m RNA表达上调,早期干预效果优于中期、晚期。mt DNA拷贝数检测结果显示:mt DNA拷贝数随时间递减,通络益肾方干预后,DKD大鼠肾小球mt DNA拷贝数表达上调,早期干预效果优于中期、晚期;ROS水平检测结果显示:ROS合成随时间呈依赖性递增,通络益肾方干预后DKD大鼠细胞内ROS水平明显下调,且22周、26周优于西药组,早期干预效果优于中期、晚期。膜电位检测结果显示:肾小球线粒体膜电位随时间递减,通络益肾方干预DKD大鼠肾小球线粒体膜电位水平升高,且26周优于西药组,早期干预效果优于中期、晚期。线粒体ATP含量检测结果显示:ATP含量随时间呈依赖性递减,通络益肾方干预后DKD大鼠肾皮质ATP含量升高,早期干预效果优于中期、晚期。结论:1、通络益肾方能够改善DKD大鼠的一般状态,具有一定程度降低尿蛋白,降低尿素氮和血清肌酐,改善肾功能。2、通络益肾方能够减轻DKD大鼠足细胞线粒体超微结构病变,对肾脏具有保护作用。3、线粒体功能障碍参与DKD肾损伤。通络益肾方可阻断DKD大鼠肾皮质线粒体功能障碍,进而减轻DKD肾小球损伤,其机制可能通过调节线粒体生物合成功能、抑制线粒体氧化应激、增加线粒体产能等途径来实现,主要表现为可上调PGC-1α、TFAM m RNA的表达,促进mt DNA的复制和转录,抑制ROS水平增强,促进ATP生成和膜电位含量的增加。4.通络益肾方早起给药效果优于通络益肾方中期、晚期给药,给药时间越长,效果越明显。