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目的:
恶性胶质瘤的外科治疗中困扰人们的问题足肿瘤残留、复发及转移病灶、卫星病灶切除困难,亚临床病灶难以发现等等。因此在外科手术的基础上,针对恶性胶质瘤的放疗、化疗及生物、基因治疗等辅助治疗的重要性已为人们所共识。靶向治疗具有效果确切,损伤小的特点,但是合适的载体很重要,寻找合适的基因治疗载体变得很迫切。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的非造血细胞,具有多向分化潜能和定向迁移能力。可诱导分化为骨、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱、肌肉细胞、神经细胞等多种细胞。特别是,骨髓细胞具有向肿瘤的趋化特性,有可能成为理想的基因治疗载体。BMSCs定向迁移的机制尚不明确。目前普遍接受的是肿瘤细胞分泌的细胞因子和BMNCs表面表达的受体间的相互作用是促进其趋化迁移的动力。阐明BMSC迁移的机制,有助于提高向肿瘤迁移的效率,可以提高基因靶向治疗的效果,同时有利于解释肿瘤形成的机制。血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)是一类重要的细胞表面粘附分子。它参与调节白细胞向微血管内皮的迁移及附着。研究表明VCAM-1在BMSC向心血管内皮的迁移中发挥作用。而VCAM-1在BMSCs向胶质瘤细胞的迁移中具有何种作用目前尚无报道。前期研究发现,血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)是较强烈吸引BMSCs迁移的因子。分析VCAM-1以及PDGF-BB在BMSC趋化迁移中的作用有助于提高其作为基因靶向治疗的载体的效率。
本研究首先建立大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养体系,并进行相关的表面标志物鉴定。同时利用体外迁移模型探讨大鼠骨髓间充质干细胞向胶质瘤细胞条件培养基的趋化迁移能力。在这一过程中,分析VCAM-1在骨髓间充质干细胞的表达情况以及胶质瘤细胞对其表达的调控。然后利用特异性阻断抗体研究VCAM-1在髓间充质干细胞向胶质瘤的迁移中的作用。然后利用不同浓度的PDGF-BB对骨髓间充质干细胞进行孵育,观察VCAM-1的表达变化并探讨P38,PI3K等信号传导通路在这一过程中的作用。
材料和方法:
一、骨髓间充质干细胞的体外培养鉴定及向胶质瘤细胞条件培养基的趋化
(一)实验材料
1、主要试剂:
L-DMEM低糖培养基,胎牛血清,兔抗大鼠CD34、CD44、CD54、CD105多克隆抗体。小鼠抗大鼠CD45多克隆抗体。DAB酶底物显色试剂盒。75cm2培养瓶(Corning)。主要耗材为Transwell小室(聚碳酸酯膜,孔径为8um,型号3422,ComingCostar公司)。
2、实验动物
健康雌性SD大鼠,4-6周龄,体重60.809,BMSCs培养原代取材使用,由中国医科大学实验动物部提供。
3、主要仪器
二氧化碳培养箱,倒置显微镜,酶标光度仪,精密PH计,电子天平,台式离心机及超净工作台。75cm2培养瓶。Transwell小室。
(二)实验方法
1、BMSC的原代取材及全骨髓贴壁法进行培养。
2、利用免疫组化及流式细胞技术鉴定BMsCs的表面标志物CD34,CD45,CD44,CD105及CD54,CD90及CD73。
3、培养胶质瘤细胞并制备条件培养基。
4、利用Transwell建立骨髓间充质干细胞体外迁移模型。
二、血管细胞粘附分子-1在骨髓间充质干细胞中的表达及其对迁移的作用
(一)实验材料
1、主要试剂:
兔抗大鼠VCAM-1多兜隆抗,LY294002,Trizol,RNAPCRKit(AMV)ver3.0,罗丹明标记的山羊抗兔荧光二抗,RIPA裂解液,小鼠抗大鼠β-actin一抗及二抗。
2、实验动物
健康雌性SD大鼠,4-6周龄,体重60.809,BMSCs培养原代取材使用,由中国医科大学实验动物部提供。
(二)实验办法
1、免疫组织化学及免疫荧光鉴定VCAM-1在BMSCs的表达。
2、C6及U87条件培养基孵育BMSC24小时,免疫荧光、RT-PCR及westernblot测定VCAM-1表达的改变。
3、Transwell体外迁移模型评估阻断VCAM-1后BMSC迁移变化。
4、免疫荧光、RT-PCR及westernblot测定LY294002对BMSC的VCAM-1表达的影响。
三、血小板衍生生长因子-BB对BMSC的VCAM-1的表达调控
(一)实验材料
1、主要试剂:
重组PDGF-BB,抑制剂为SB203850,LY294002,SP600125,PD98059及BAY11-7082。兔抗大鼠VCAM-1多克隆抗体,TRizol(Invitrogen)。RNAPCRKit(AMV)ver3.0(Takara)。
2、实验动物
健康雌性SD大鼠,4-6周龄,体重60.809,BMSCs培养原代取材使用,由中国医科大学实验动物部提供。
(二)实验方法
l、利用酶联免疫反心监测胶质瘤细胞培养上清中PDGF-BB的含量。
2、以0,10,20,50,100ng/ml的不通过浓度PDGF-BB孵育BMSCs24小时。
3、免疫荧光、RT-PCR及westernblot测定VCAM-1表达量的改变。
4、50ng/ml浓度的PDGF-BB孵育同时加入SB203850(10μM),LY294002(30μM),SP600125(10μM),PD98059(10μM)及BAY11-7082(5μM)。免疫荧光、RT-PCR及westernblot测定抑制剂对BMSC的VCAM-1表达的影响。
结果:
一、骨髓间充质干细胞的体外培养鉴定及向胶质瘤细胞条件培养基的趋化
1、全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,3天后即可观察到贴壁细胞,4天以后呈指数级生长。一周后形成集落,并以集落化方式扩增。大约12-14天生长至80-90%融合。细胞形态比较均一,呈长梭型,呈旋涡状、铺路石状,生长较密集。
2、BMSC不表达CD34、CD45,阳性表达CD44、CD54、CD105,CD90及CD73。
3、体外迁移实验证实C6及U87胶质瘤细胞的条件培养基吸引BIdSCs迁移。
二、血管细胞粘附分子-1在骨髓间充质干细胞中的表达及其对迁移的作用
1、免疫组织化学染色及免疫荧光证实BMSC表达VCAM-1。
2、BMSCs向胶质瘤的迁移可因阻断VCAM-1而受到抑制。
3、免疫荧光、RT-PCR及westernblot证实C6及U87胶质瘤细胞使BMSCs显著上调表达VCAM-1。
4、加入P13K抑制剂LY294002后,增强的VCAM-1表达受到显著抑制。
三、血小板衍生生长因子-BB对BMSCs的VCAM-1的表达调控
1、ELISA结果显示胶质瘤培养上清含有PDGF-BB,平均浓度为6.11ng/L和7.75ng/L。
2、免疫荧光、RT-PCR及Westernblot结果显示PDGF-BB显著促进BMSCs表达VCAM-1。
3、10,20ng/ml的PDGF-BB未对BMSCs中VCAM-1的mRNA和蛋白的表达产生有统计学意义的影响,而50,100ng/ml的PDGF-BB显著上调了BMSCs中VCAM-1的mRNA和蛋白的表达。
4、P13K及P38MAPK,NF-κB的抑制剂SB203850、LY294002及BAY11-7082分别显著抑制了PDGF-BB诱导的VCAM-1mRNA和蛋白的表达上调。
结论:
1、骨髓间充质干细胞易于体外培养扩增,不表达造血干细胞的标志物CD34及CD45,阳性表达CD44、CD54、CD105、CD90及CD73。具有向C6或U87胶质瘤细胞培养上清的趋化迁移的能力。
2、BMSCs上存在VCAM-1的表达,C6及U87条件培养基显著上调了BMSC的VCAM-1的mRNA和蛋白质的表达。同时VCAM-1在骨髓间充质干细胞向胶质瘤的迁移过程中发挥作用。
3、PI3K信号通路参与C6或U87胶质瘤细胞对骨髓间充质干细胞VCAM-1表达的调控。
4、PDGF-BB显著增强BMSCs中VCAM-1mRNA和蛋白的表达,P38MAPK、PI3K及NF-κB分别参与此上调过程。