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鸡白痢沙门菌(Salmonella enterica serovar Pullorum)是一类禽致病性革兰阴性杆菌。雏鸡感染后表现为急性败血症,以拉白色粥样或黏性粪便为特征,呈现高发病率和高死亡率。成年鸡感染后表现为隐性带菌或慢性经过,不造成死亡。鸡白痢沙门菌不仅能够水平传播,还可以经蛋垂直传播,导致了鸡蛋孵化率的降低和雏鸡死亡率的升高。在许多发展中国家,鸡白痢沙门菌仍是家禽养殖业中危害严重的细菌之一,造成了巨大的经济损失。为控制鸡白痢,国内外采取了一系列措施,包括疫苗免疫、抗生素治疗、检疫淘汰和生物安全措施等。多年实践表明,在特定情况下,疫苗接种是防控鸡群鸡白痢的最有效措施之一。用于防控沙门菌的疫苗主要分为灭活疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗三种,而减毒活疫苗以其安全性好、稳定性强、在减毒的同时不丧失免疫原性等优点,被认为是较为理想的疫苗。良好的减毒活疫苗必须保持细菌毒力和免疫保护效力之间的平衡,因此,利用基因工程构建减毒活疫苗的关键在于靶基因的选择。本文选择fur和speDE基因作为减毒靶基因,利用λ-red同源重组系统,构建了鸡白痢沙门菌S06004△fur△speDE基因缺失株,并对其生物学特性进行了评价,初步探讨了该基因缺失株作为减毒活疫苗的可行性。1鸡白痢沙门菌△furAspeDE基因缺失株的构建及其LD50测定本研究成功构建了鸡白痢沙门菌S06004Afur△speDE基因缺失株。PCR鉴定和测序结果表明,fur和speDE基因敲除成功。与野生株相比,S06004△fur△speDE的部分生物化学特性发生了改变,且S06004△fur△speDE的生长速度慢于野生株的生长速度。通过遗传稳定性分析,S06004△fur△speDE连续传至50代后,缺失的基因不能够再回复。以海兰白品系雏鸡为动物模型,对S06004△fur△speDE进行毒力评价,结果表明,与野生株相比,S06004△fur△speDE的LD50提高了约105倍,而S06004△fur和S06004△speDE的LDso仅分别提高了约73.4倍和4.95倍。这些结果说明speDE和fur基因的缺失造成了鸡白痢沙门菌S06004毒力的下降,S06004△fur△speDE具有良好的安全性,可作为减毒活疫苗候选株进行后续研究。2减毒鸡白痢沙门菌△fur△speDE免疫生物学特性初步研究本研究通过细胞和雏鸡模型初步评价了S06004△fur△speDE的免疫生物学特性。以S06004△fur△speDE和野生株分别感染禽巨噬细胞HD-11后发现,S06004△fur△speDE对细胞的黏附能力与野生株相比无显著差别,但侵袭细胞及在细胞内增殖的能力显著降低(P<0.05)。基因缺失株在机体内消减动态的分析及其免疫保护效力的评价结果显示,S06004△fur△speDE以口服和肌肉注射2种途径分别免疫3日龄雏鸡后,在口服组中,免疫10天后S06004△fur△speDE在肝脏和脾脏中被清除,而肌注组在免疫21天后,S06004△fur△speDE在肝脏和脾脏中被清除。S06004△fur△speDE以口服和肌注2种方式分别免疫3日龄雏鸡2周后,再分别以口服和肌注方式攻毒,结果显示,S06004△fur△speDE以2种方式免疫2周后,能够对野生菌攻毒提供100%免疫保护,其体重净增量也比未免疫组有所提高；肝脏和脾脏病理切片显示,组织病变程度明显轻于未免疫组。间接ELISA检测血清中IgG抗体和黏膜IgA抗体的产生水平,结果显示S06004△fur△speDE能诱导机体产生较高水平的IgG抗体和IgA抗体。荧光定量PCR方法检测S06004AfurAspeDE免疫过程中肝脏细胞因子的表达,结果显示,与对照组相比,IFN-y表达水平上调。以上结果表明,S06004△fur△speDE除了具有良好的安全性外,还能够提供良好的免疫保护,为其作为沙门菌减毒活疫苗候选株奠定了坚实基础。