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自转基因作物商业化应用以来,耐除草剂一直是转基因作物的主要性状,2019年耐除草剂转基因作物的种植面积占全球转基因作物种植面积的46%。转基因耐除草剂作物的大面积种植带来了巨大的经济和社会效益,但草甘膦抗性杂草的出现也引起了人们对其产生的环境风险的广泛关注。基因拆分技术培育的转基因作物能够很好的避免目标性状逃逸到环境中所带来的影响,是防控基因飘流和防止耐草甘膦杂草产生的有效措施。为了利用基因拆分技术培育aroAA1501基因耐草甘膦水稻,本研究通过结构分析法筛选基因的可拆分位点,并通过功能互补试验获得基因的可拆分位点,通过原核系统分析比较不同位点拆分后,在intein介导下重新组装蛋白的草甘膦耐受性及酶动力参数,获得适宜的可拆分位点,研究结果为利用基因拆分技术培育耐草甘膦的转基因水稻提供技术支撑,同时为利用基因拆分技术防控基因飘流、预防耐草甘膦杂草产生提供技术储备。具体研究结果如下:1)生物信息学分析预测aroAA1501基因编码的EPSPS蛋白的一级结构、二级结构和三级结构,根据蛋白结构预测出了13个可能拆分的位点。利用PCR的方法将aroAA1501拆分成N端（An）和C端（Ac）两部分,并通过融合PCR法分别与Ssp DnaE intein的N端（In）和C端（Ic）结合形成融合基因An-In和Ic-Ac。2)以pETDuet-1载体为基础载体,构建单独An-In或Ic-Ac、以及同时An-In和Ic-Ac的原核表达载体,并导入aroA缺陷型菌株ER2799进行功能互补试验。发现只有同时含有140N-In和Ic-141C、224N-In和Ic-225C、230N-In和Ic-231C以及完整aroAA1501的ER2799重组菌株能在含有20 mM草甘膦MOPs限制性培养生长。RT-PCR结果显示在同时含有140N-In和Ic-141C、224N-In和Ic-225C、230N-In和Ic-231C的ER2799重组菌株中不能扩增到完整的aroAA1501基因。上述结果表明,aroAA1501基因在140/141、224/225和230/231位点拆分后,在intein介导下能重新组装成完整有功能蛋白,赋予重组ER2799菌株耐受草甘膦的能力。3)将含有不同质粒的ER2799重组菌株接种到不同草甘膦浓度的MOPS培养基上,进行草甘膦耐受性分析。结果发现aroAA1501基因在不同位点拆分后重新组装成的功能蛋白对草甘膦的耐受性存在差异,其中140/141位点拆分后重新组装蛋白能耐受20 mM的草甘膦,低于完整蛋白的草甘膦耐受性;224/225位点拆分后重新组装蛋白与完整蛋白对草甘膦的耐受性基本一致,能耐受40 mM的草甘膦,而230/231位点拆分后重新组装蛋白耐耐受120 mM的草甘膦,比完整蛋白对草甘膦的耐受性提高了2倍。4)荧光定量PCR分析了不同ER2799重组菌株中外源基因的表达情况。发现融合基因140N-In、224N-In和230N-In的表达量高于完整aroAA1501基因;而融合基因Ic-141C、Ic-225C和Ic-231C的表达量低于aroAA1501基因,其中Ic-231C的表达量最低,说明不同ER2799重组菌株对草甘膦的耐受性差异不是由于基因表达差异造成的。5)ELASA酶活测定结果表明,在140/141和224/225处拆分后,其重新组装成的功能蛋白的酶活与完整蛋白的基本一致;在230/231处拆分后,其重新组装成的功能蛋白的酶活比完整蛋白的要高,达到0.05差异显著水平。6)分析了来源于不同ER2799重组菌株中EPSP合酶的酶动力相关参数,发现230/231位点拆分后重新组装成的EPSPS的酶活为17.861±0.267,IC50约为10880,Km值为56.8,Ki值为29.4;140/141位点拆分后重新组装成的EPSPS酶活为5.33±0.533,IC50约为2700,Km值为82.4,Ki值为48.6;224/225位点拆分后重新组装成的EPSPS酶活为9.27±0.133,IC50约为4770,Km值为125.7,Ki值为79;完整aroAA1501蛋白的酶活为9.29±0.133,IC50约为4600,Km值为122.28,Ki值为85。上述结果表明230/231位点拆分后重新组装成的EPSPS的酶活最高,与底物和草甘膦的的结合能力最强。7)以DT-2300为基础载体,构建了同时含有140N-In和Ic-141C、224N-In和Ic-225C、230N-In和Ic-231C植物表达载体,通过农杆菌转化法导入转基因水稻,获得含有完整aro AA1501基因、同时含有140N-In和Ic-141C、224N-In和Ic-225C、230N-In和Ic-231C的转基因植株分别为26、24、21和20株。8)对转基因水稻苗进行草甘膦耐受性分析,发现转完整aro AA1501基因以及230N-In和Ic-231C的转基因水稻苗可以耐受2000 ppm草甘膦