灰树花（Grifola frondosa）作为食药兼用蕈菌,富含多糖、蛋白和微量元素等营养成分。研究表明,灰树花多糖,特别是葡聚糖,具有显著的抗肿瘤、免疫增强、降血糖等功能。本课题组前期已开展了灰树花多糖结构解析、功能评价及其合成途径等研究,推测灰树花葡聚糖合成主要依赖UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase of G.frondosa,GFUGP）合成UDP-葡萄糖,并由葡聚糖合成酶聚合而成。然而,有关GFUGP在灰树花菌体生长和多糖合成过程中的功能和作用的研究还未见报道。因此,在前期研究的基础上,本论文基于NCBI数据库公布的灰树花全基因组序列,克隆测序gfugp,并对其进行全面的生物信息学分析,并通过构建gfugp沉默菌株分析沉默gfugp对灰树花菌体形态、菌体/多糖产量、多糖组成及其合成途径中相关基因转录水平的影响,以期探明GFUGP在灰树花发酵过程中菌丝体生长和多糖合成中的主要功能。（1）灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gfugp的克隆和生物信息学分析。克隆测序并重新注释了灰树花UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gfugp,其gDNA全长为2036 bp,与云芝、绣球菌及密黏褶菌等ugp基因相似度均大于80%。该基因编码463个氨基酸,GFUGP蛋白属于UDP-葡萄糖焦磷酸化酶家族,包含一个UGPase特征功能域,在氨基酸残基103³11具有16处底物结合位点。GFUGP定位于胞内,无跨膜信号肽,其三级结构为八聚体。选取89个不同来源的UGP构建系统发育树,90%以上是真菌UGP及其氨基酸序列与GFUGP的同源性为80%⁹1%。其中,GFUGP与其他担子菌科（或多孔菌科）,如茯苓、硫黄多孔菌和栎迷孔菌的UGP属于同一分支,说明它们具有相似的进化时间,同源性较好。但其与酵母、植物、动物和人类来源的UGP同源性较低,仅为30%⁵0%。（2）通过沉默灰树花gfugp基因,分析了gfugp对灰树花菌丝体在平板上生长的影响。选取gfugp基因的保守区域,构建沉默质粒pAN7-gfugp-dual,PEG-CaCl₂法介导转入灰树花原生质体,通过潮霉素平板筛选得到8株iGFUGP阳性转化子。qRT-PCR结果表明,与野生株WT相比,阳性转化子中gfugp转录水平显著下调至0.23⁰.68。考察了gfugp转录水平不同的转化子iGFUGP1、iGFUGP5和iGFUGP6在PDA平板上的生长性能。结果显示,WT菌株平均生长速度为4.93±0.17 mm/d,gfugp沉默菌株生长速度显著减缓。其中,iGFUGP1菌株平均生长速度最低,为2.25±0.22 mm/d,仅为WT的45.63%。显微观察发现,野生株WT菌株的菌丝密集,呈多层致密外观,而iGFUGP菌株的菌丝较为稀疏,菌丝直径变粗,且分枝明显增多。（3）考察了gfugp沉默对灰树花发酵菌丝体量、多糖产量、多糖中单糖组成及多糖合成途径中相关基因转录水平的影响。结果显示,经7 d发酵后,WT菌株的菌球直径约为4300±93μm,菌丝体量为25.5 g/L,而iGFUGP菌株的菌球直径和菌丝体量分别降低至1044±84μm²082±76μm和12.2 g/L¹7.3 g/L;WT菌株的菌丝体多糖得率和胞外多糖产量分别为0.39 g/g和6.93 g/L;而iGFUGP菌株菌丝体多糖得率和胞外多糖量分别减少至0.08 g/g⁰.14 g/g和3.10g/L⁵.07 g/L。单糖组成分析结果表明,iGFUGP菌株的菌丝体多糖中的单糖组成与WT一致,但葡萄糖含量下降了2%¹3%,阿拉伯糖比例上升了2%¹3%;而iGFUGP菌株胞外多糖的葡萄糖含量降为66.79%⁷2.08%,阿拉伯糖含量分别增加为18.02%和33.21%,且发现了2.3%以上的甘露糖和7.3%的半乳糖。qRT-PCR结果提示,iGFUGP菌株中ugp、uge和gls表达水平均有较明显下降,uxe显著上调,与菌丝体多糖和胞外多糖中单糖组成变化趋势基本一致。因此,推测gfugp沉默可能会减少UDP-葡萄糖供给,进而影响菌丝体和胞外多糖的产量和单糖组成,最终干扰了灰树花菌体生长和发酵性能。