一、背景与目的肺癌是全球范围内发病率和死亡率均位居第一的恶性肿瘤,非小细胞肺癌大约占了 4/5,其中又以腺癌最为常见。对于进展期NSCLC患者,多药耐药的产生是限制其临床疗效的重要原因。肿瘤细胞耐药现象的最终形成是一个多基因、多因素的复杂过程,涉及关键信号通路上众多癌基因和抑癌基因的调控异常。MiRNA是表观遗传调控体系的重要组分,可在转录后水平负向调控基因表达。近期研究表明miRNA及其靶基因可形成功能反馈性调控通路,广泛参与肿瘤发生发展和耐药形成。前期研究发现:miR-200b/E2F3功能轴表达紊乱与肺腺癌耐药表型形成密切相关,并发现E2F3b可能对miR-200b产生负向调控。本课题在前期成功建立耐多西他赛人肺腺癌细胞模型、miRNA-200b生物信息学及功能学分析的基础上,拟采用荧光素酶报告基因、凝胶阻滞、染色质免疫共沉淀、位点突变、基因干涉及过表达等实验方法,分析肺腺癌耐药细胞中E2F3b与miR-200b间的负反馈调控关系,并通过体外细胞和活体动物模型分析E2F3b/miR-200b负反馈通路参与调控肺腺癌细胞化疗敏感性的可能机制,为临床逆转肺腺癌耐药提供新的策略。二、方法与结果方法:1.生物信息学分析miR-200b基因P2启动子区的E2F3结合位点。利用GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/Nucleotide)检索并结合以往文献报道,获取miR-200b基因P2启动子全长序列(-1004～+34)。接下来,利用RT-PCR方法从结肠癌细胞基因组DNA中扩增miR-200b基因P2启动子全长序列,利用分子克隆技术成功构建该启动子调控的萤火虫荧光素酶质粒载体(pGL3-miR-200b/promoter),并构建多种启动子区部分缺失型突变体,分别转染SPC-A1/DTX细胞,利用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒测定萤火虫荧光素酶活性。随后通过启动子在线分析软件CoreBoost_HM(http://rulai.cshl.edu/tools/CoreBoost_HM/)及转录因子结合位点在线分析软件 TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)、CONSITE(http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite)对该核心启动子区进行分析。2.E2F3a和E2F3b真核表达载体构建。针对人E2F3a和E2F3b基因表达编码框分别设计PCR引物,以肺腺癌细胞SPC-A1为cDNA模板,利用PCR方法扩增并克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)(购自上海英骏生物科技有限公司)的BamHI和XhoI酶切位点之间。利用PCR引物在线设计软件设计引物并进行BLAST同源性筛选,引物由上海生工生物工程有限公司合成,载体构建成功后进行测序验证,分别命名为:pcDNA/E2F3a、pcDNA/E2F3b。3.E2F3干涉表达载体构建。利用Ambion在线siRNA序列分析软件设计E2F3基因干涉序列并进行BLAST同源性筛选,序列由上海吉玛生物公司合成,正义及反义链退火后克隆到真核表达载体pSilencer4.1-CMVneo(购自美国Ambion公司)的BamHI和HindⅢ酶切位点之间。克隆成功后进行测序验证,命名为:pSil/shE2F3。4.基因转染、稳定筛选及目的基因检测。分别将pcDNA/E2F3a、pcDNA/E2F3b质粒载体转染入亲本细胞株SPC-A1及H1299中,将pSil/shE2F3质粒载体转染入耐药细胞株SPCA-1/DTX及H1299/DTX中,同时设空载体转染对照组。G418抗生素稳定筛选后,将得到的稳定转染细胞系分别命名为:SPC-A1/pcDNA/E2F3a、SPC-A1/pcDNA/E2F3b和 SPCA-1/DTX/shE2F3;H1299/pcDNA/E2F3a、H1299/pcDNA/E2F3b 和H1299/DTX/shE2F3。以 Western Blot 法检测 E2F3 蛋白表达水平;参照 TaqMan(?)MicroRNA检测试剂盒(购自美国ABI公司)说明书,以荧光实时定量RT-PCR法检测miR-200b表达水平。5.验证E2F3(a/b)、miR-200b表达与肺腺癌耐药表型相关性。通过稳定转染以人为改变SPC-A1/DTX及SPC-A1细胞中E2F3表达水平,荧光实时定量RT-PCR和/或Western Blot法检测E2F3和miR-200b表达情况,MTT法测定细胞对多西他赛IC50值。6.利用 qRT-PCR 和 Western Blot 分别检 E2F3a 和 E2F3b 在 SPC-A1/DTX、H1299/DTX 耐药细胞和相应SPC-A1、H1299亲本细胞中的mRNA和蛋白表达水平。如前述得到稳定转染的两对细胞系 SPC-A1/pcDNA/E2F3a、SPC-A1/pcDNA/E2F3b、SPCA-1/DTX/shE2F3和 H1299/pcDNA/E2F3a、H1299/pcDNA/E2F3b、H1299/DTX/shE2F3,分别在 mRNA水平和蛋白水平进行验证。7.启动子活性测定。利用脂质体Lipofectamine 2000介导法,分别将pcDNA/E2F3a、pcDNA/E2F3b与含有miR-200b核心启动子序列的质粒载体pGL3-miR-200b/promoter共转染 SPC-A1 细胞,将 pSil/shE2F3 与 pGL3-miR-200b/promoter 共转染 SPC-A1/DTX 细胞,利用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒测定萤火虫荧光素酶活性。8.染色质免疫共沉淀实验。利用甲醛固定法使SPC-A1/DTX细胞中miR-200b启动子区与其相结合的转录调控因子交联,使用E2F3b特异性抗体与E2F3b结合,沉淀法分离复合物,PCR法扩增与各转录因子特异性结合的启动子序列,获得细胞内E2F3b与miR-200b启动子直接结合的证据。9.细胞水平分析E2F3b/miR-200b负反馈通路参与调控肺腺癌细胞化疗敏感性的可能机制。利用MTT法测定其多西他赛的IC50值。体外验证E2F3b影响肺腺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期。利用克隆形成实验分别测定各组体外增殖率差异;利用流式细胞技术,分别检测各组细胞的早期凋亡率和细胞周期分布情况。10.拯救试验验证E2F3b通过miR-200b途径参与肺腺癌化疗耐药形成。上述构建SPC-A1/pcDNA/E2F3b 和 H1299/pcDNA/E2F3b 中分别共转染 miR-NC mimics 或共转染miR-200 mimics,与 SPCA-1/NC、SPC-A1/pcDNA/E2F3b 及 H1299/NC、H1299/pcDNA/E2F3b一起分别进行四组间DTX的MTT法分析IC50、增殖、凋亡以及细胞周期中G2/M相分布比例;上述构建SPCA-1/DTX/shE2F3和H1299/DTX/shE2F3分别共转染miR-NC inhibitor或共转染miR-200 inhibitor与SPCA-1/DTX/NC、SPCA-1/DTX/shE2F3和1299/DTX/NC、H1299/DTX/shE2F3一起进行四组间DTX的MTT法分析IC50、增殖、凋亡以及细胞周期中G2/M相分布比例。11.活体动物水平分析E2F3b/miR-200b负反馈通路参与调控肺腺癌细胞化疗敏感性。将pSil/shE2F3及对照质粒分别转染到SPC-A1和SPC-A1/DTX/细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型。密切观察成瘤情况,当瘤体直径达5mm左右时,分别给予DTX(20mg/kg)行腹腔内注射治疗,按公式a×b2/2(a为长径,b为短径)计算皮下瘤体积(单位是mm3),绘制生长曲线。打药注射35天后处死,剥离瘤块提取肿瘤组织的总RNA和蛋白,qRT-PCR和Western Blot法检测miR-200b和E2F3b表达水平差异。利用免疫组化法检测各组肿瘤组织中Ki67和PCNA 阳性表达水平。利用TUNEL法对石蜡包埋的肿瘤组织切片中的细胞进行凋亡原位检测,分析各组凋亡率差异。结果:1.miR-200b基因P2启动子的核心区域位于-200～+34处。该核心启动子内含有一个潜在的 E2F3 结合位点(5’-TTTC[A]CGC-3’),位于-133～-126 处。2.对比亲本SPC-Ai细胞,耐药SPC-A1/DTX细胞较存在显著的E2F3过表达。在SPC-A1/DTX细胞中敲除E2F3基因表达后,miR-200b表达水平显著升高,同时细胞对多西他赛敏感性增高;另一方面,在SPC-A1细胞中过表达E2F3a时miR-200b表达无明显改变,而过表达E2F3b时则出现miR-200b表达降低并伴随多西他赛敏感性降低。3.qRT-PCR结果显示与亲本株SPC-A1和H1299相比,耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中的miR-200b的表达水平明显降低(p<0.01);在亲本细胞中分别转染了过表达E2F3a和E2F3b的质粒,在耐药细胞中转染了干扰E2F3的质粒,E2F3b过表达后亲本细胞的miR-200b表达量明显下降,而E2F3a过表达后变化不明显。耐药珠中干涉E2F3后miR-200b表达量明显升高(p<0.01)。在亲本细胞SPC-A1和H1299细胞中分别转染了过表达E2F3a和E2F3b的质粒后通过qRT-PCR结果及western blot检测验证其过表达效果(p<0.01)。同样在耐药珠中转染了三种E2F3干涉表达载体,根据qRT-PCR结果及western blot结果挑选出来干扰效果最好的3号载体进行后续试验(p<0.01)。4.ChIP实验结果显示在SPC-A1和SPC-DTX细胞系里转录因子E2F3都可以调控miR-200b启动子区域,验证了 E2F3与miR-200b启动子直接结合。荧光素酶活性测定发现在SPC-A1细胞中过表达E2F3b可以降低miR-200b基因启动子活性,SPC-DTX细胞中干扰E2F3可升高miR-200b基因启动子活性(p<0.01),验证了 E2F3b能够直接调控miR-200b启动子活性。5.MTT实验分别测定其对DTX的IC50值,过表达E2F3b后IC50值显著升高,亲本细胞的化疗敏感性减低,而相反干扰掉E2F3后,体外化疗敏感性升高(p<0.01)。证实E2F3b/miR-200b轴与肺腺癌细胞多西他赛敏感性密切相关。6.克隆形成实验结果表明:过表达E2F3b后明显增强了亲本细胞的体外增殖能力,而下调E2F3表达抑制了耐药珠细胞的体外增殖能力(p<0.01)。流式细胞术检测细胞凋亡结果表明:亲本细胞中过表达E2F3b后明显减弱细胞凋亡,过表达E2F3a并未观察到明显效果。而下调E2F3表达增强了耐药株的细胞凋亡。流式细胞术检测细胞周期结果表明:亲本细胞中过表达E2F3b后明显缩短G2M期,延长S期(p<0.05),而下调E2F3表达明显延缓了 G2M 期(p<0.01)。7.在亲本细胞中转染E2F3b过表达载体,同时共转染miR-200b及其对应的NC组,检测miR-200b的表达变化,可以发现共转染200b后E2F3b过表达引起的miR-200b表达减低被逆转(p<0.01)。MTT结果表明过表达E2F3b使化疗敏感性降低可部分通过miR-200b而逆转;抑制E2F3b后升高的化疗敏感性可通过加入miR-200b抑制剂后又降低(p<0.01)。克隆形成实验结果表明:过表达E2F3b后亲本细胞的体外增殖能力增强,共转染miR-200b以后体外增殖能力又减弱,同样抑制E2F3b后体外增殖力降低可通过加入miR-200b抑制剂后又逆转(p<0.01)。流式细胞术检测细胞凋亡,过表达E2F3b后亲本细胞凋亡减弱,共转染miR-200b以后凋亡又明显增强,同样抑制E2F3b后增强的凋亡可通过加入miR-200b抑制剂后又逆转(p<0.01)。流式细胞术检测细胞周期,过表达E2F3b后亲本细胞G2M期缩短,S期延长,共转染miR-200b以后可以部分逆转,同样抑制E2F3b后G2M期延长,S期缩短也可以通过加入miR-200b抑制剂后又逆转(p<0.01)。8.收集转染干扰E2F3载体的人肺腺癌亲本细胞和耐药株,构建裸鼠皮下移植瘤,给予DTX腹腔内注射后测量绘制肿瘤生长曲线。结果表明:给予DTX药物后,与对照组比较,干扰E2F3组肿瘤体积明显小于对照组.剥离肿块提取各组肿瘤组织的总RNA和蛋白,Western Blot法检测E2F3b表达水平差异,与细胞水平的表达变化是一致的。qRT-PCR检测miR-200b的表达,结果显示亲本细胞和耐药细胞中,干扰E2F3后,miR-200b的表达量都有不同程度的升高(p<0.01)。利用免疫组化法检测各组肿瘤组织中E2F3的表达量,发现耐药细胞E2F3的表达高于亲本细胞,干扰后都明显减弱。Ki67和PCNA的免疫组化染色结果表明干扰E2F3组的Ki67和PCNA阳性率明显低于对照组。Tunel染色结果表明干扰E2F3组的细胞凋亡水平也都低于对照组。结论与意义:1.耐药SPC-A1/DTX细胞较亲本SPC-A1细胞存在显著的E2F3过表达。2.E2F3b 的表达在DTX耐药细胞LAD细胞中的表达明显高于亲本。过表达E2F3b后能够明显减低miR-200b的表达,而过表达E2F3a并没有看到明显效果。反过来干扰E2F3后miR-200b的表达明显升高。E2F3b参与了人肺腺癌耐药细胞miR-200b的表达调控。3.确认了 E2F3b与miR-200b基因启动子区的直接结合和调控作用。4.E2F3b/miR-200b负反馈通路可以在体内、体外层面参与调控人肺腺癌的化疗耐药。5.首次分析了肺腺癌细胞中E2F3b/miR-200b功能负反馈调控通路及其参与肺腺癌耐药形成的相关机制,目前国内外尚未见有报道。为阐明miR-200b在肺腺癌耐药形成中的生物学功能及调控机制提供实验依据,并为肺腺癌的分子靶向治疗探索新型分子标志物和治疗靶点。