第一部分实验研究:基于自噬相关信号通路探讨清热解毒法对AS的影响目的:通过构建新西兰兔AS模型,研究清热解毒中药对AS斑块、炎症因子、凋亡及自噬和其相关信号通路的影响,从而探讨清热解毒中药是否通过调节自噬而达到稳定斑块的作用,并对其具体分子机制进行探索。方法:新西兰雄兔70只,适应性喂养7天后,随机分为7组（n=10）包括空白组、模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组,氯喹组及立普妥组,其中正常对照组喂食普通饲料（每只120～140 g/d,共16周）,其余各组喂食高脂饲料（配方2%胆固醇,2%猪油,94%普通饲料,每只120～140 g/d,共16周）,并在第4、8、12周,于右侧耳动脉,颈动脉和股浅动脉旁肌肉注射LPS（每个部位肌注lug,0.1mL注射用水溶解,每只兔子每次共肌注3ug LPS）。从第8周开始,黄连解毒汤低剂量组、黄连解毒汤中剂量组和黄连解毒汤高剂量组开始以黄连解毒汤0.75g/kg/d、1.5 g/kg/d和3 g/kg/d灌胃,阿托伐他汀组以1mg/kg/d的阿托伐他汀灌胃;氯喹组在给予高剂量黄连解毒汤的同时,给予氯喹（自噬抑制剂,50mg/kg/d,作用为提升溶酶体内PH值,阻断溶酶体与自噬体的融合,从而阻断自噬过程）腹腔注射,干预8周。第16周末,所有兔子均用药物诱发斑块破裂（静脉按0.02 mg/kg剂量注射组胺）,药物诱发前后使用IVUS观察主动脉斑块形态。药物诱发24小时后,处死全部动物,检测如下指标:1.生化分析法检测血脂水平（TC、TG、LDL-C、HDL-C）,鲎试剂法检测血清LPS水平,ELISA法检测血清CRP、IL-1水平;2.主动脉斑块稳定性分析:①HE染色,观察斑块破裂的发生率;②IVUS测定外弹性膜面积（EEMA）、管腔面积（LA）、斑块面积（PA）和斑块负荷（PB）;③免疫组化法（IH）测定斑块内巨噬细胞含量和平滑肌（a-SMA）细胞含量,苦味酸天狼星红染色测定斑块内胶原纤维含量,油红0染色测定斑块内脂质含量,从而计算斑块的不稳定性指数（vulnerability index,Ⅵ）:Ⅵ=（巨噬细胞染色%+脂质染色%）/（平滑肌细胞%+胶原纤维%）。3.炎症水平评价:IH染色测定斑块内MMP9蛋白表达。巨噬细胞凋亡、坏死评价:TUNEL染色法测定斑块内巨噬细胞凋亡,免疫荧光法测定斑块内凋亡蛋白Caspase-3表达。HE染色测量斑块内细胞坏死程度。巨噬细胞对凋亡细胞清除能力评价:观察斑块内与凋亡细胞（TUNEL阳性）关联的巨噬细胞（F4/80标记）数,和自由巨噬细胞（F4/80标记）数之间的比率,评价巨噬细胞对凋亡巨噬细胞的清除能力。4.自噬水平评价:①使用透视电镜观察巨噬细胞中自噬体;②免疫荧光法检测LC3-Ⅱ表达;③IH法检测Atg5-Atg12复合物、p62/SQSTM1表达。自噬调控蛋白检测:IH法检测 mTOR、Akt、AMPK表达。结果:1.黄连解毒汤各剂量和立普妥都可以下调血清TG、LDL-C、TC,升高HDL,且中药高剂量组和立普妥组优于中药中剂量及低剂量组及氯喹组（P<0.05）,黄连解毒汤高剂量组和立普妥组无明显差异（P>0.05）。2.黄连解毒汤各剂量和立普妥都可以降低血清CRP、LPS、IL-1水平,其中在CRP方面中药低剂量组CRP水平高于中药中剂量组和立普妥组（P<0.05）;中药中剂量组及氯喹组CRP水平高于中药高剂量组（P<0.05）;氯喹组CRP水平高于立普妥组（P<0.05）。在LPS方面,中药低剂量组及中药中剂量组LPS水平高于中高组（P<0.05）;中药高剂量组低于氯喹组和立普妥组（P<0.05）。在IL-1方面与模型组相比,各干预组IL-1水平明显下降,有统计学差异（P<0.05）;中药低剂量组IL-1水平高于中药高剂量组和立普妥组,低于氯喹组（P<0.05）;中药中剂量组及中药高剂量组及立普妥组IL-1水平低于氯喹组（P<0.05）。3.HE染色:①空白组:主动脉内膜层完整,单层扁平细胞,无增生;中膜层平滑肌以及弹性纤维走形一致,无明显异常。②模型组:主动脉内膜均匀重度增厚,增厚斑块主要由泡沫细胞、胶原、沉积脂质、大量坏死物质和胆固醇结晶组成,周围可见炎性细胞浸润,可见明显的纤维帽;局部中膜层增厚。③中药低剂量组:主动脉内膜不均匀的重度增厚,斑块主要由大量的纤维细胞、部分泡沫细胞和少量炎症细胞组成;中膜层结构紊乱,可见多处坏死钙化灶。④中药中剂量组:主动脉内膜局部中度增厚,斑块多见不同程度的钙化坏死,部分损伤侵及中膜层,平滑肌及弹性纤维嗜碱性增强,部分坏死钙化。⑤中药高剂量组:主动脉内膜局部轻度增厚,增生的斑块中未见坏死及钙化性改变,斑块中可见少量泡沫细胞,未见炎性细胞浸润,表面可见纤维帽状结构,中膜层平滑肌及弹性纤维排列未见明显增厚和紊乱,血管管腔未见明显狭窄。⑥氯喹组:主动脉内膜明显向管腔中突起,管腔狭窄,内膜明显增厚可见一层薄薄的纤维帽,在动脉斑块中可见一长条形的钙化灶,周围可见明显的炎性细胞浸润,斑块中可见大量泡沫细胞组成,中膜层中平滑肌细胞发生泡沫化改变。⑦立普妥组:主动脉内膜局部有少量小的脂肪斑块,管腔未见明显狭窄,斑块中可见少量泡沫细胞,未见明显纤维帽,局部中膜层未见炎症细胞浸润,动脉管壁未见明显增厚。4.IVUS检测:①EEMA各组间无统计学差异（P>0.05）;②LA方面,模型组与空白组相比有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）;各干预组与模型组相比,黄连解毒汤高剂量组及立普妥组较模型组明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）;各干预组之间比较:黄连解毒汤高剂量组及立普妥组较黄连解毒汤中、低剂量组及氯喹组明显增加,有显著差异（P<0.05）,而氯喹组较黄连解毒汤中、低剂量组有所下将,差异有统计学意义（P<0.05）;然而黄连解毒汤低剂量与中剂量组相比以及立普妥组与黄连解毒汤高剂量组皆无明显统计学差异（P>0.05）。③PA方面,模型组较空白组明显增大,有统计学差异（P<0.05）;各干预组与模型组相比:黄连解毒汤低、中、高剂量及立普妥组较模型组有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）,氯喹组与模型组相比较,无明显统计学差异（P>0.05）;各干预组间比较:黄连解毒汤高剂量组和立普妥组较黄连解毒汤低、中剂量组明显下降,有统计学差异（P<0.05）,氯喹组与黄连解毒汤低、中剂量组相比,有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）,而黄连解毒汤低剂量组与中剂量组相比,无统计学差异（P>0.05）;黄连解毒汤高剂量组和氯喹组相比,明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）,而与立普妥组相比,则无明显统计学差异（P>0.05）。④PB方面,模型组较空白组明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）;各干预组与模型组相比:黄连解毒汤低、中、高剂量组和立普妥组明显低于模型组,差异有统计学意义（P<0.05）,氯喹组与模型组相比有下降趋势却无统计学意义（P>0.05）;各干预组间比较:黄连解毒汤高剂量组和立普妥组与黄连解毒汤低、中剂量组相比,明显下降,有统计学差异（P<0.05）,氯喹组与黄连解毒汤低、中剂量组相比,有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）,而黄连解毒汤低剂量组与中剂量组相比,无统计学差异（P>0.05）;黄连解毒汤高剂量组和氯喹组相比,明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）,而与立普妥组相比,则无明显统计学差异（P>0.05）。5.斑块不稳定指数:模型组斑块不稳定指数与空白组相比,有所升高,差异有统计学意义（P<0.05）;各干预组与模型组相比,其斑块不稳定指数有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）;各干预组之间相比:与黄连解毒汤低剂量组相比,立普妥组及黄连解毒汤中、高剂量组斑块不稳定指数有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）,而氯喹组斑块不稳定指数则有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与黄连解毒汤中剂量组相比,立普妥及黄连解毒汤高剂量组斑块不稳定指数有所下降,具有统计学差异（P<0.05）,氯喹组斑块不稳定指数则有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与黄连解毒汤高剂量组相比,立普妥组斑块不稳定指数无明显统计学差异（P>0.05）,氯喹组斑块不稳定指数明显上升,差异有统计学意义（P<0.05）;立普妥组与氯喹组相比,其斑块不稳定指数明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。6.斑块中MMP9表达:模型组与空白组相比,其斑块中MMP9水平皆高于空白组,存在明显统计学差异（P<0.05）;各干预组与模型组相比,其斑块中MMP9水平明显下降,有统计学差异（P<0.05）;各干预组之间相比,立普妥组及黄连解毒汤中、高剂量组其斑块中MMP9低于黄连解毒汤低剂量组,差异有统计学意义（P<0.05）,而氯喹组与黄连解毒汤低剂量组相比,无明显统计学差异（P>0.05）;与黄连解毒汤中剂量组相比,氯喹组斑块中MMP9水平有所上升而黄连解毒汤高剂量组及立普妥组其斑块中MMP9水平明显下降,差异皆有统计学意义（P<0.05）;与黄连解毒汤高剂量组相比,氯喹组斑块中MMP9水平明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）,而立普妥组与之相比,则无明显差异（P>0.05）。7.斑块中TUNNEL染色检测凋亡水平:与空白组相比,模型组凋亡水平明显上升,差异有统计学意义（P<0.05）;各干预组与模型组相比:立普妥组、氯喹组及黄连解毒汤低、中、高剂量组较模型组明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）;各干预组间比较:立普妥组及黄连解毒汤中、高剂量组较黄连解毒汤低剂量组明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）,氯喹组与黄连解毒汤低剂量组相比,无统计学差异（P>0.05）;立普妥组及黄连解毒汤高剂量组较黄连解毒汤中剂量组明显下降,有统计学差异（P<0.05）,氯喹组较黄连解毒汤中剂量组有所增加,有统计学差异（P<0.05）;黄连解毒汤高剂量组及立普妥组明显低于氯喹组,有统计学差异（P<0.05）,然而黄连解毒汤高剂量组与立普妥组相比,无明显统计学意义（P>0.05）。8.斑块中自噬水平评价:①在AMPK方面:模型组与空白组相比,无明显统计学差异（P>0.05）;各干预组与模型组相比,其斑块中AMPK水平皆有所升高,皆有统计学差异（P<0.05）;各干预组之间相比,与黄连解毒汤低剂量组相比,立普妥组及黄连解毒汤中、高剂量组其斑块中AMPK皆明显升高,有统计学差异（P<0.05）,氯喹组与之相比则有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）;与黄连解毒汤中剂量组相比,黄连解毒汤高剂量组及立普妥组其斑块中AMPK有所上升,有统计学差异（P<0.05）,氯喹组与之相比有所下降,差异有统计学差异（P<0.05）;与黄连解毒汤高剂量组相比,氯喹组斑块中AMPK明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）,而立普妥组与之相比则无明显统计学差异（P>0.05）。②在Akt方面:与空白组相比,模型组斑块中Akt有所升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比,各干预组斑块中Akt皆有所下降,皆有统计学差异（P<0.05）;各干预组之间相比:与黄连解毒汤低剂量组相比,立普妥组及黄连解毒汤中、高剂量组斑块中Akt有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）,而氯喹组斑块中Akt水平有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与黄连解毒汤中剂量组相比,立普妥及黄连解毒汤高剂量组斑块中Akt有所下降,差异有统计学意义,而氯喹组斑块中Akt水平有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与黄连解毒汤高剂量组相比,氯喹组斑块中Akt水平有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）而立普妥组与之相比则无统计学差异（P>0.05）。③在mTOR方面:与空白组相比,模型组斑块中mTOR水平有所升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比,立普妥及黄连解毒汤各剂量组斑块中mTOR有所下降,差异皆有统计学意义（P<0.05）,氯喹组斑块中mTOR水平有下降趋势,然而无统计学差异（P>0.05）;各干预组之间相比:与黄连解毒汤低剂量组相比,立普妥组及黄连解毒汤中、高剂量组斑块中mTOR水平有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）,而氯喹组斑块中mTOR水平有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与黄连解毒汤中剂量组相比,立普妥及黄连解毒汤高剂量组斑块中mTOR水平有所下降,差异有统计学意义（P<0.05）,而氯喹组斑块中Akt水平有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）;与黄连解毒汤高剂量组相比,氯喹组斑块中mTOR水平有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）而立普妥组与之相比则无统计学差异（P>0.05）。结论:1.黄连解毒汤各剂量组和立普妥可以降低模型动物血清LDL-C、TC、TG水平,升高HDL水平,且黄连解毒汤具有剂量依赖性。2.黄连解毒汤各剂量组和立普妥可以降低IL-1、CRP、LPS水平,抑制炎症反应,高剂量组效果更明显,其中在降低LPS方面,黄连解毒汤高剂量组优于立普妥。3.黄连解毒汤可以拮抗高脂等复合因素所致AS斑块的形成,可以保护血管内膜、减轻内膜增生,减少泡沫细胞、炎症细胞浸润,减少脂质及胆固醇结晶沉积,一定程度上对AS斑块起稳定作用,且以黄连解毒汤高剂量组最为明显,提示呈剂量依赖性,其效果与立普妥相当。4.黄连解毒汤及立普妥可不同程度减小斑块面积（PA）及斑块负荷（PB）,增加管腔面积（LA）,其中黄连解毒汤呈现出剂量依赖效应,而氯喹似乎对黄连解毒汤的效应发挥一定拮抗作用。5.黄连解毒汤及立普妥可以降低斑块不稳定指数（Ⅵ）,具有稳定斑块的作用,其中黄连解毒汤的稳斑作用呈剂量依赖性,剂量越高稳斑效果越好;同时该研究发现氯喹对黄连解毒汤的稳斑作用呈现出一种拮抗效应,研究已经证实适度自噬有利于斑块稳定,因此我们推测黄连解毒汤的稳斑效应似乎与自噬有关,有待进一步研究。6.黄连解毒汤及立普妥具有下调斑块中MMP9表达的作用,具有一定的抗炎稳斑作用,其中以黄连解毒汤高剂量组及立普妥组下调MMP9表达最为明显,提示黄连解毒汤具有一定剂量依赖性。同时我们注意到,氯喹这种自噬抑制剂似乎可以削弱黄连解毒汤下调MMP9表达的作用。7.黄连解毒汤各剂量及立普妥均有抑制凋亡的作用,其中黄连解毒汤呈剂量依赖性,剂量越高抑制凋亡的作用越明显,甚至黄连解毒汤高剂量在抑制凋亡方面与立普妥无明显差异,然而黄连解毒汤的作用似乎可被氯喹所干扰,研究中发现,氯喹组（黄连解毒汤高剂量灌胃+氯喹腹腔注射）其凋亡率与黄连解毒汤低剂量组无差异,高于黄连解毒汤中、高剂量组,提示氯喹对黄连解毒汤的抗凋亡作用起到拮抗作用。8.黄连解毒汤与立普妥对自噬信号通路具有一定影响,可以下调Akt-mTOR表达,上调AMPK表达,其中黄连解毒汤高剂量组及立普妥明显优于黄连解毒汤低、中剂量组,然而黄连解毒汤高剂量组和立普妥组则无明显差异,同时我们观察到氯喹组斑块中Akt-mTOR水平明显升高,AMPK水平则有所下降,提示其对黄连解毒汤所致Akt-mTOR下调及AMPK上调有拮抗作用。9.研究发现采用立普妥及黄连解毒汤进行干预,可能通过抑制Akt-mTOR信号通路,提高AMPK信号通路而提高自噬水平,减少巨噬细胞凋亡,抑制斑块中炎症反应,进而稳定AS斑块,且其中黄连解毒汤呈剂量依赖型。第二部分 临床研究AMI证型规律研究目的:该研究主要收集近3年来因为急性心肌梗死（AMI,Acute myocardium infarction）收住我院心内科的病人,经四诊合参对其进行辨证,并采集其病史、收集其住院期间的理化等辅助检查、介入资料、住院期间不良心血管事件（main adverse cardiovascular event,MACE）等,然后进行回顾性研究,归纳AMI患者证型分布,病变情况,短期预后,并着重研究胸痹真心痛热毒证的危险因素,对其进行单因素及多因素Logistic回归分析,为更好地指导临床提供基础及临床数据。方法:从2015年1月至2018年1月这段时间因为AMI在我院心内科住院并且满足纳入标准的病人,采用登录嘉禾病例系统检索、电话联系及门诊随诊诸多方式收集患者的详尽资料,填写《AMI患者调查表》然后数据录入,进行单因素、多因素logistic回归分析。结果:1.本次研究收集病例共327例,纳入者年龄最小的22岁,最大的93岁,平均年龄59.76±12.99岁;男性266例,占81.3%,女性61例,占18.7%;符合热毒证的有137例,占41.9%,非热毒证的有190例,占58.1%。AMI急性期中医证型以实证居多,共计252例（77.1%）,虚实夹杂74例（22.7%）;其中实证中最多的为热毒血瘀证,有136例,占41.6%,其次为痰瘀互结型,有109例,占33.3%;虚实夹杂证中则以气虚血瘀证最为多见,有68例,占20.8%。2.热毒组与非热毒组的泵功能衰竭、恶性心律失常、机械性并发症、低血压状态、肺部感染和住院期间死亡等方面的病情情况比较,热毒组与非热毒组的泵功能衰竭、低血压状态和肺部感染的发生率存在统计学差异（P<0.05）,表现为非热毒组的泵功能衰竭发生率（37.4%）、低血压状态发生率（31.6%）和肺部感染发生率（24.7%）均明显高于热毒组的泵功能衰竭发生率（18.2%）、低血压状态发生率（13.9%）和肺部感染发生率（13.9%）。而热毒组与非热毒组的恶性心律失常、机械性并发症和住院期间死亡的发生率不存在统计学差异（P>0.05）。3.327例研究对象中心肌梗死类型为STEMI的有301例,占92.0%,NSTEMI为26例,占 8.0%;LM、LAD、LCX、RCA 和 MACE 分别为 16例（4.9%）、274例（83.8%）、174例（53.2%）、216 例（66.1%）和 45 例（13.8%）;单支病变有 110 例,占 33.6%,双支病变有115例,占35.2%,三支病变有101例,占30.9%;热毒组与非热毒组心肌梗死类型与冠脉血管病变情况比较,热毒组与非热毒组的心肌梗死类型与冠脉血管病变情况均不存在统计学差异（P>0.05）。4.热毒组与非热毒组的心脏彩超各指标比较,热毒组与非热毒组的心脏彩超各指标均不存在统计学差异（P>0.05）。5.单因素分析结果:热毒组与非热毒组的性别、年龄、抽烟、饮酒、家族史等基本情况的比较,热毒组与非热毒组的性别、年龄和家族史存在统计学差异（P<0.05）,表现为非热毒组的女性比例（25.3%）明显高于热毒组（9.5%）;非热毒组的平均年龄为63.26±13.24岁,明显大于热毒组的54.91±10.95岁;非热毒组的家族史比例（7.9%）明显低于热毒组（15.3%）;而两组的吸烟、饮酒、高血压、糖尿病和心律失常比例均不存在统计学差异（P>0.05）。热毒组与非热毒组的实验室检查指标比较,热毒组与非热毒组的hs-CRP和Lp-PLA2存在统计学差异（P<0.05）,表现为热毒组的hs-CRP和Lp-PLA2明显大于非热毒组,其它指标均不存在统计学差异（P>0.05）。6.多因素分析结果:由以上单因素分析可知,热毒组和非热毒组的性别、年龄、家族史、hs-CRP和Lp-PLA2均存在统计学差异。故以热毒组和非热毒组为因变量,性别、年龄、家族史、hs-CRP和Lp-PLA2为自变量进行非条件的二分类logistic回归分析,经检验,χ 2=34.653,P<0.05,说明回归模型有统计学意义,因此在性别、年龄、家族史、hs-CRP和Lp-PLA2中仅有年龄为热毒证候的独立因素,OR值为0.947,小于1,说明年龄为热毒证候的保护因素,表现为年龄越大,热毒证候的发生率越低。结论:AMI急性期中医证型以实证、虚实夹杂证居多,证候分布依次为热毒血瘀证、痰瘀互结证、气虚血瘀证。热毒证与年龄、家族史、hs-CRP和Lp-PLA2有关,进一步多因素分析后发现年龄是热毒证的独立要素,年龄越大,热毒证发生率越低,提示我们对于年轻人应当特别注意热毒证的存在,治疗上应当特别重视清热解毒,对于老年人特别是非热毒证患者应当警惕泵功能衰竭、低血压状态和肺部感染的出现,一旦发生应当及早干预以期改善预后。