背景慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease COPD)是常见的慢性呼吸系统疾病,其临床特征主要以气流受限并伴有进行性肺功能下降。由于COPD病程迁延,且患病率、致残率及病死率较高,可对患者的生活质量造成严重的影响。与此同时,也给社会和家庭带来沉重的社会和经济负担。目前在全球范围内,COPD是危害居民呼吸系统健康的重要疾病,由COPD导致的直接和间接死亡率占全死亡病因的第四位。此外,随着吸烟人群比例的增高,在2020年COPD相关死亡率仍会逐渐增高。在我国30岁以上群体中,COPD患病率约为6.2%,而呼吸系统疾病在我国是农村地区首位,城区地区第四位的死亡原因。目前现有的治疗方式并不能显著的降低COPD的发生发展,逆转由疾病造成的气流受限,但合理规范的治疗方式仍然可以起到对症的目的,并且改善患者活动耐力和生活质量。随着新的疾病管理模型—精准医学概念的提出,结合COPD患者内在的生物学信息及外在的临床表现,未来针对COPD患者实施个性化精准治疗的目的有望在临床上达到。因此探索新的生物标记物在COPD患者体内的表达成为一个十分有意义的研究方向。研究表明,COPD患者的发生、发展及预后受多种血清标记物的影响。主要包括 C 反应蛋白(C-reaction protein CRP)、降钙素原(procalcitonin PCT)、尼克酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)、肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α TNF-α)、内皮素-1(endothelin ET)、白介素-6(interleukin IL-6)、脂联素(adiponectin ADP)、尿酸(uric acid UA)、纤维蛋白原、生成分化因子-15(growth differentiation factor-15 GDF-15)、Clara 细胞蛋白 16(clara cell protein 16 CC16)、嗜酸性粒细胞、和肽素、血清淀粉样蛋白A(serun amyloid A SAA)以及人软骨蛋白YKL-40等等。然而血清基质金属蛋白酶(matrix metalloprote inases-9 MMPs-9)及巨噬细胞刺激蛋白(macrophage stimulating protein MSP)在COPD患者不同临床表型中的表达及其关联的影响因素尚无定论。研究表明MMPs是调节细胞外基质降解合成的主要酶类,其表达水平与气道炎症的修复重塑之间存在显著关联。在COPD患者的肺组织、支气管肺泡灌洗液和诱导痰中能够检测到MMPs,但其升高的水平对他们的活性不是必须的。此外,MMPs在吸烟者支气管肺泡灌洗液中的水平要显著高于非吸烟者,其水平与气流阻塞之间存在负相关。之前研究表明MMP-9参与气道结构破坏、重塑和降解肺泡壁基质,此外,MMP-9还参与调解细胞因子和其他蛋白酶的活性,其在肺气肿的发生发展过程中发挥重要的作用。因而推断,MMP-9与COPD慢性炎症反应、气道修复与重塑及肺气肿形成过程可能存在关联。同理,MSP作为具有免疫调节活性的糖蛋白主要在肝脏合成,其在于特异性受体酪氨酸激酶RON结合后,可以通过刺激肺泡巨噬细胞进而产生氧自由基和细胞因子,进而调节细胞分化、迁移和基质的侵袭。因而推断,MSP与COPD的发生发展之间存在密切关联并且可以影响肺功能等相关指标。目的在本研究中,我们通过设置COPD患者和相匹配的对照组,观察MMP-9及MSP在观察组和对照组中的表达水平。此外,MMP-9及MSP在不同表型COPD患者中的表达水平也进行了比较。最后,对影响不同表型COPD患者MMP-9及MSP表达水平的因素进行探讨。研究方法和内容样本来源第一部分选取于2015年12月～2018年1月东南大学附属盐城医院呼吸内科入院的COPD患者47例为观察组,并选取同时期我院体检中心体检者30例为对照组。第二部分选取不同表型的COPD患者81例,其中肺气肿型(A组)48例,支气管扩张表型(B组)25例,其他表型(C组)8例。患者入组标准:(1)符合COPD诊断标准即符合中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013修订版)》:吸入支气管扩张剂后FEV1/FVC<0.7,视为持续性气流受限,方可诊断为COPD;(2)年龄≥40岁;(3)患者及家属知情同意并签署知情同意书。对照组入组标准:(1)年龄≥40岁;(2)无吸烟史;(3)进行健康检查且肺功能正常、身体各机能指标均正常的健康人;(4)受试者知情同意并签署知情同意书。所有受试者具有以下任意一条或多条特征时则应退出本研究(排除标准):(1)不符合上述纳入标准者;(2)有严重心脑血管疾病、肝肾功能衰竭、意识障碍;(3)5年内有恶性肿瘤史;(4)不愿参与本项研究者。表型分类、MMP-9及MSP测定参考2013年捷克指南将观察组中81例慢性阻塞性肺病患者分为A、B、及C三种临床表型,并根据患者吸烟情况将患者分为吸烟组和非吸烟组。使用广州瑞博奥生物科技有限公司提供MMP-9、MSP试剂盒,对所有受试者在次日清晨空腹抽取肘静脉血10ml,室温下1000转离心5分钟,留取上清液,-80℃冻存待测,血清标本严格按照说明书进行MMP-9、MSP测定。数据收集及影响MMP-9及MSP的因素所有入选者采集信息如下:性别、年龄、体重身高指数(body mass index BMI)、病史、是否城市人口、是否接触生物燃料、吸烟状态、肺动脉压、氧分压、二氧化碳压、脑钠钛、白细胞、中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞、嗜酸性粒细胞百分比、痰培养、心脏病史、高血压、糖尿病、FEV1、FEV1%、用力肺活量(forced vital capacity FVC)、及 FEV1/FVC。统计分析分析前对数据进行正态性及方差齐性检验。符合正态分布的计量资料采用x±s表示,非正态分布资料采用中位数(四分位数间距)来表示。基线资料的分析针对计量资料采用t检验、方差分析及非参数检验;针对计数资料比较采用卡方检验。分析观察组和对照组间MMP-9及MSP表达水平采用t检验或非参数检验。针对不同表型COPD患者间MMP-9及MSP表达水平的比较采用方差分析,多重比较采用LSD检验。组间Spearman相关分析法并逐个绘制散点图。多因素相关性分析采用多元逐步线性回归分析。P<0.05为差异有统计学意义,所有统计应用SPSS 19.0软件进行分析。研究结果观察组与对照组MMP-9及MSP表达水平的比较观察组包含47例血清样本,而对照组包含30例血清样本。观察组MMP-9表达水平为(323.94±270.06 ng/ml)明显高于健康对照组(217.91±134.24 ng/ml)(P=0.0402),两者差异有统计学意义;观察组MSP表达水平为(158235.1 ±76887.45 ng/ml)明显高于健康对照组(38787.05±35668.51 ng/ml)(P<0.0001),两者差异有统计学意义。观察组中A、B、C三型COPD基线指标比较共81例不同表型的COPD患者参与分析,其中A型48例,B型25例、及C型8例。我们发现三种不同表型COPD组间性别(P=0.0022)、BMI(P=0.0013)、吸烟包/年(P<0.0001)、吸烟状态(P<0.0001)、嗜酸性粒细胞(P=0.0002)、及嗜酸性粒细胞百分比(P=0.0001)差异存在统计学意义。与此相反,三种不同表型在年龄(P=0.0894)、病史(P=0.1665)、是否城市人口(P=0.5593)、是否接触生物燃料(P=0.5154)、肺动脉压(P=0.2137)、氧分压(P=0.7793)、二氧化碳压(P=0.3637)、白细胞(P=0.0783)、中性粒细胞百分比(P=0.1674)、心脏病史(P=0.5595)、高血压(P=0.8100)、糖尿病(P=1.000)、FEV1(P=0.8099)、FEV1%(P=0.3417)、FVC(P=0.3634)、及FEV1/FVC(P=0.1216)组间差异无统计学意义。观察组中A、B、C三型MMP-9及MSP表达水平比较观察组中A型患者48例,MMP-9表达水平为320.41±268.29 ng/ml、MSP表达水平为155820.70±77882.66 ng/ml;B型患者25例,MMP-9表达水平为323.02±354.40 ng/ml、MSP 表达水平为 184360.45±93059.75 ng/ml;C 型患者 8例,MMP-9 表达水平为 299.96±157.35 ng/ml、MSP 表达水平为 252622.17 ±123718.30 ng/ml。结果指出三组MMP-9表达水平无统计学意义(P=0.980)。三组间MSP表达差异有统计学意义,经两两比较发现MSP在A型患者体内表达水平显著低于C型,其他组间两两比较均无统计学意义。在COPD吸烟和非吸烟患者及其A、B、C三型中MMP-9及MSP表达水平的比较共38例不同表型的COPD吸烟者参与分析,其中A型10例,B型23例、及C型5例。A型MMP-9的表达水平为316.19±305.62 ng/ml,B型MMP-9的表达水平为 262.86±206.52 ng/ml,C 型 MMP-9 的表达水平为 350.79±185.02 ng/ml。我们发现组间MMP-9表达水平差异无统计学意义,且两两比较发现组间差异均无统计学意义(P>0.05)。此外,A型MSP的表达水平为152658.88±73370.61 ng/ml,B型MSP的表达水平为180554.19±95961.49 ng/ml,C型MSP的表达水平为284880.86±134831.11 ng/ml。方差分析结果显示三种表型COPD患者内MSP表达水平差异有统计学意义(P<0.05),进一步两两比较发现A(P=0.017)、B型患者MSP表达水平均显著低于C型患者(P=0.035)。共43例不同表型的COPD不吸烟者患者参与分析,其中A型38例,B型2例、及C型3例。A型MMP-9的表达水平为 321.52±262.13 ng/ml,B型MMP-9的表达水平为1014.76±1017.81 ng/ml,C型MMP-9的表达水平为215.25±31.16 ng/ml。方差分析发现组间MMP-9表达水平差异有显著的统计学意义(P<0.05),进一步两两比较发现,A和B型MMP-9表达水平差异有统计学意义(P=0.003),此外,B和C型MMP-9表达水平差异有统计学意义(P=0.006)。此外,A型MSP的表达水平为 156652.76±79951.47 ng/ml,B型MSP 的表达水平为228132.39±32989.28 ng/ml,C 型 MSP 的表达水平为 198857.70±101367.76 ng/ml。方差分析结果显示三种表型COPD的MSP表达水平之间的差异无统计学意义,进一步两两比较发现组间差异均无统计学意义。影响血清MMP-9、MSP表达水平的因素及其与肺功能的相关性共81例不同表型的COPD患者参与分析,其中A型48例,B型25例、及C型8例。首先,我们发现BMI(P=0.015)、及白细胞(P=0.008)在A型COPD中的水平对MMP-9的表达水平有显著的影响。其次,吸烟状态(P=0.001)、生物燃料(P=0.040)在B型COPD中的水平对MMP-9的表达水平有显著的影响。再次,病史(P=0.017)在C型COPD中的水平对MMP-9的表达水平有显著的影响。第二,病史(P=0.035)在A型COPD中的水平对MSP的表达水平有显著的影响。其次,所有纳入因素对B型COPD MSP的表达水平的影响均无统计学意义(P>0.05)。再次,病史(P=0.001)、白细胞(P=0.004)、及肺动脉压(P=0.025)在其它型COPD中的水平对MSP的表达水平有显著的影响。我们对MMP-9与MSP在COPD患者体内的表达水平与肺功能相关指标的关联进行分析,结果发现MMP-9的表达水平与FEV1的水平之间存在显著的负相关(P=0.029);MMP-9的高表达会造成FEV1(%)的降低(P=0.022);MMP-9的表达水平与FVC的水平之间存在显著的负相关(P=0.043),但是,MMP-9的表达水平与FEV1/FVC 比例之间的关联无统计学意义(P=0.088)。最后,我们发现MSP在COPD患者体内的表达水平与FEV1(P=0.476)、FEV1(%)(P=0.903)、FVC(P=0.894)、及 FEV1/FVC 比例(P=0.249)之间的关联无统计学意义。结论1.观察组COPD患者血清MMP-9、MSP表达水平明显高于对照组,说明MMP-9、MSP的表达水平参与COPD的发病机制。2.COPD患者A、B、C表型间嗜酸性粒细胞、及嗜酸性粒细胞百分比差异有统计学意义。3.COPD患者A、B、C表型间MMP-9表达水平无统计学意义,但三组间MSP表达差异有统计学意义。4.吸烟者A、B、C表型间MMP-9表达水平差异无统计学意义,但三组间MSP表达水平差异有统计学意义;与此相反,不吸烟者A、B、C表型间MMP-9表达水平差异有显著的统计学意义,但三组间MSP表达水平差异无统计学意义。5.BMI、及白细胞在A型COPD中的水平对MMP-9的表达水平有显著的影响;吸烟状态、生物燃料在B型COPD中的水平对MMP-9的表达水平有显著的影响;病史在C型COPD中的水平对MMP-9的表达水平有显著的影响。病史在A型COPD中的水平对MSP的表达水平有显著的影响;所有纳入因素对B型COPD MSP的表达水平的影响均无统计学意义;病史、白细胞、及肺动脉压在其它型COPD中的水平对MSP的表达水平有显著的影响。MMP-9的表达水平与FEV1、FEV1(%)、及FVC的水平之间均存在显著的负相关。背景慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是常见的慢性呼吸系统疾病,可累计全身各个系统器官。其临床特征主要以气流受限并伴有进行性肺功能下降。由于COPD病程迁延,且患病率、致残率及病死率较高,对于患者的生活质量造成严重的影响,也给社会和家庭带来沉重的社会和经济负担。目前在全球范围内,COPD是危害居民呼吸系统健康的重要疾病,由COPD导致的直接和间接死亡率占全死亡病因的第四位。一般认为COPD发病的主要发病机制包括了慢性炎症反应,氧化/抗氧化失衡,蛋白酶/抗蛋白酶失衡等。其中,MMPs是调节细胞外基质降解合成的主要酶类,其表达水平与气道炎症的修复重塑之间存在显著关联。其中MMP9是MMPs家族中的一员,主要作用为降解细胞外基质。MMP9主要在巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞等细胞中表达,参与气道结构破坏、气道炎症反应、气道重塑、调解细胞因子和其他蛋白酶的活性。其在COPD的发生发展过程中发挥重要的作用。所以抑制MMP9的表达及活性可为COPD的防治提供新的研究方向。目的本研究将通过MMP9选择性抑制剂SB-3CT干预大鼠COPD模型。观察抑制MMP9活性后,是否会对COPD疾病的进展过程中炎性反应、氧化应激反应及MSP(MST-1)/RON表达产生影响,为进一步临床预防及治疗COPD提供研究基础。研究方法和内容动物分组及干预方式将大鼠随机分成3组,每组8只,分别设定为对照组;模型组;治疗组。对照组不做任何处理,模型组通过香烟烟熏法建立COPD模型,治疗组在COPD模型基础上给予SB-3CT(50mg/kg)干预。肺部组织检测对各组大鼠肺部组织取材后进行苏木精-伊红染色进行镜下观察,并采用免疫组织化学方法检测肺组织内MSP(MST-1)、MMP9、iNOS蛋白的表达情况。肺泡巨噬细胞检测通过吉姆萨染色和迪夫快速染色观察大鼠肺泡巨噬细胞大体密度和形态,并检测细胞内一氧化氮含量及一氧化氮合成酶活性。进一步研究了细胞中RON,MMP9,iNOS的mRNA转录和蛋白表达情况。肺泡灌洗液检测应用酶联免疫分析(ELISA)法测定肺泡灌洗液中大鼠MSP(MST-1),TNF-α,IL-1β 浓度。研究结果肺部组织检测SB-3CT干预缓解了 COPD模型中大鼠肺泡结构被破坏,减少了炎性细胞的浸润。免疫组化结果提示MSP(MST-1)蛋白染色中,模型组表达量显著高于治疗组(Wilcoxon秩和检验,P=0.0273);MMP9蛋白染色中,模型组表达量显著高于治疗组(Wilcoxon秩和检验,P=0.0273),iNOS蛋白染色中,模型组表达量显著高于治疗组(Wilcoxon秩和检验,P=0.0273)。肺泡巨噬细胞检测吉姆萨染色和迪夫快速染色结果提示模型组大鼠肺泡灌洗液中细胞数量较多。对各组大鼠肺泡巨噬细胞进行NO及iNOS生化指标检测。NO测定结果显示模型组为 85.62±18.49μ M,显著高于治疗组的 42.99±10.23μ M(P<0.001)。iNOS活性检测结果显示模型组为351.82±60.86,显著高于治疗组的178.09±48.16(P<0.001)。在大鼠肺泡巨噬细胞RON、MMP9、iNOS蛋白的表达结果中,模型组RON蛋白表达量为13757.14(12577.35-17899.01)显著高于治疗组10107.55(8622.321-12943.99),P=0.0209。MMP9 蛋白表达量为,模型组 2610.06(11345.19-17287.92)同样显著高于治疗组 8453.893(7392.847-11808.9),P=0.0274。iNOS 蛋白表达量为,模型组 8058.529(6541.528-12138.83)显著高于治疗组 4663.286(3730.725-6754.671),P=0.0274。Realtime PCR 法检测大鼠肺泡巨噬细胞内RON,MMP9,iNOS的mRNA转录结果。RON在模型组结果为0.0321182±0.0061654 显著高于治疗组的 0.0136875±0.0033243,p<0.001。MMP9结果分别为:模型组:0.0104691±0.0021502;治疗组:0.0044161±0.0017602,模型组显著高于治疗组,P<0.001。iNOS结果分别为:模型组:0.0150488±0.003004;治疗组:0.0051904±0.0010381,模型组显著高于治疗组,P<0.001。肺泡灌洗液检测ELISA方法分析各组大鼠肺泡灌洗液中,MSP(MST1)、TNF-α、IL-1β蛋白浓度。其中MSP(MST-1)在模型组表达0.90±0.21ng/ml显著高于治疗组0.50±0.16ng/ml,P<0.001。TNF-α 在模型组表达 56.74±12.58ng/L 显著高于治疗组 29.02±1083ng/L,P<0.001。IL-1β 在模型组表达 394.59±97.48ng/L 显著高于治疗组 222.89±60.35ng/L,P<0.001。结论MMP9抑制剂SB-3CT能够降低大鼠COPD模型肺组织中MMP9的表达,并能够降低大鼠肺泡巨噬细胞中RON的转录及表达,以及肺泡液中MSP(MST-1)的浓度。并且SB-3CT的干预能够改善COPD病理过程中的氧化应激反应,并能够降低肺泡液中的炎性介质含量。所以SB-3CT可能通过以上抗炎、抗氧化及对MSP(MST-1)/RON蛋白的抑制作用,延缓了 COPD的发生发展,最终缓解了香烟烟雾对大鼠肺泡组织的破坏。