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背景癌症严重危害人类健康,目前仍然是一个难以攻克的医学难关。临床上用于癌症治疗的方法主要有手术治疗,化学疗法和放射疗法等。其中,化学疗法依然是主流的首选方法,也是放射疗法与手术治疗的协同方法。经典的化学疗法通常采用小分子化学药物干扰细胞分裂过程,以促进肿瘤细胞凋亡或坏死。尽管这些细胞毒性药物作为临床一线抗癌药物已经取得了良好的疗效,但其也存在一些缺陷,例如靶向性差,生物利用度低,毒副作用大,以及易促使癌细胞产生多药耐药性等。为减少这些弊端,联合应用两种或多种药理机制不同或毒副作用不同的抗癌药物用于癌症的治疗的方案,即联合化疗（combination chemotherapy）应运而生。目前,联合化疗已成为许多癌症的标准治疗方法。随着纳米技术在制药领域的发展,基于联合化疗的理念,将至少两种具有理化性质不同和药理机制相异的抗癌药物加载到同一纳米药物递送系统（NDDS）中,称为纳米药物联合递送系统（NDCDS）。与使用两种游离药物的联合化疗相比,NDCDS在突破生物屏障、高靶向性、增强在癌组织的渗透能力以及控制药物释放等方面具有优势,能更好地使化疗药物产生协同作用。近年来,大多数NDCDS仅将两种或多种药物加载到同一种纳米粒中,可被称为药物联合递送单纳米颗粒（single nanoparticles for drug co-delivery,SNDCD）。其优点为:显著提高模式药物在肿瘤区域的积累,产生协同效应以提高抗肿瘤效果。但也有不足之处,如被荷载的两种药物,由于其理化性质不同,通常载药率与包封率不同,因而在递药时无法准确定量各类药物的剂量;其次,荷载在同一物理空间,SNDCD在储藏或递药时可能导致药物相互之间发生物理或化学作用,最终可能影响疗效。恶性肿瘤是复杂的组织,不仅包括癌细胞,还包括基质细胞,如内皮细胞,成纤维细胞和许多免疫细胞,以及它们产生的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）。这种由肿瘤细胞,基质细胞和细胞外基质所构成的集合体,被称为肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）。越来越多的研究表明TME在肿瘤的发生和迁移中起着重要作用。以TME中的关键细胞为药物作用靶点可用于肿瘤的治疗。实验目的基于TME、联合化疗的理论,并与当代纳米递药技术相结合,我们提出将抗癌药物长春新碱（VCR）与抗纤维化药物吡非尼酮（PFD）分别荷载在不同的纳米颗粒中(CPNPVCR和PPNPPFD),期望这种联合递送策略可提高抗癌效果的科研假设。创新性地设计与制备用于递送靶向TME中癌细胞与癌相关成纤维细胞（CAFs）的小分子药物的二元混合药物联合递送纳米颗粒（Binary blended nanoparticles for drug co-delivery,BBN-DCD）,并对其理化表征、生物效应与机理进行了探讨。实验方法1.制备与表征我们采用乳化-溶剂挥发法成功制备了CPNP、CPNPVCR和CPNPRh123,采用薄膜分散法成功制备了PPNP、PPNPPFD和PPNPC6。同时对所制备的纳米粒进行了物理化学表征的检测。通过透射电子显微镜观察了纳米粒的表面形态和分散情况。通过激光共聚焦显微镜观察了可荧光示踪的纳米粒CPNPRh123和PPNPC6的混悬液,以评估两种纳米粒混合后的聚集情况。采用ZetaPALS高分辨电位及粒度分析仪对纳米颗粒的粒径和表面电荷进行了检测。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X衍射（X-RD）检测游离药是否被成功包载进纳米颗粒中。使用UV-Vis分光光度计检测了纳米颗粒的包载率和载药率,以及体外pH敏感性释放的情况。2.体外细胞培养和NIH/3T3的诱导活化我们选用的模式细胞为人非小细胞肺癌细胞（A549）和小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）。为了获得癌相关成纤维细胞（CAFs）,我们在体外用转化生长因子TGF-β1对NIH/3T3进行诱导活化,并用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测了CAFs细胞的标记蛋白,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和成纤维活化蛋白（FAP）的表达量,以评估NIH/3T3细胞是否被成功活化为CAFs细胞。3.体外细胞毒性实验利用WST-1的方法评估了纳米材料的细胞毒性,并检测了游离药和纳米药对A549和CAFs细胞的细胞毒性,分别计算了半抑制浓度(IC50)和协同指数(CI50),以评估我们的纳米共递药系统抗肿瘤细胞增殖的协同作用。4.生物效应和机理研究在生物效应的研究中,我们建立了A549和CAFs细胞的非接触性体外共培养模型,对该共培养模型进行不同的给药方式处理48 h后,观察A549的增殖情况,并用流式细胞术检测了A549的凋亡情况,以此评估CAFs对A549的增殖或凋亡的邻近效应。此外,我们还通过蛋白免疫印迹法（Western blot）评估了PFD对CAFs的逆转作用。结果1.纳米颗粒的物理化学表征我们制备的几种纳米颗粒粒径均在100-200 nm,粒径均一且分散性良好。由于纳米粒的表面均带负电荷,将CPNPVCR和PPNPPFD的水溶液混合后,纳米粒也未发生聚集现象。傅里叶红外和X衍射结果显示,游离药均已成功载入纳米粒中。UV-Vis分光光度计检测到两载药纳米粒均具有较高的包封率和载药率,能够满足本研究后续实验的需求。此外,体外药学释放实验中,纳米粒CPNPVCR和PPNPPFD能够响应不同的pH,实现药物的控释。2.NIH/3T3细胞的诱导活化NIH/3T3细胞的活化效果呈现出TGF-β1浓度依赖性和时间依赖性。我们用ImageJ软件对Western blot条带定量分析后,发现TGF-β1以10 ng/ml的浓度处理NIH/3T3细胞48 h后,活化效果最好。3.体外细胞毒性实验纳米材料对A549和CAFs细胞毒性较低,可以被用于递药载体。而药物的细胞毒性结果显示,CPNPVCR对细胞有显著的毒性作用,当CPNPVCR和PPNPPFD共递药时,细胞毒性显著增强,且具有一定的协同作用。4.生物效应和机理研究当A549和CAFs共培养后,A549的细胞密度显著高于A549单独培养时,表明CAFs在一定程度上能够促进A549细胞的增殖。当共培养模型经过共递药CPNPVCR+PPNPPFD处理后,结果显示CAFs的生长被抑制后,可以显著提高抗癌药物VCR的治疗效果。同时,我们还发现抗纤维化药物PFD（也是一种TGF-β1的抑制剂）不仅可以逆转CAFs细胞由激活状态转变为静息状态,而且还可以抑制NIH/3T3细胞被TGF-β1诱导为CAFs细胞。结论在本研究中,我们创新性设计并制备了一种二元混合药物联合递送纳米颗粒（BBN-DCD）:CPNPVCR和PPNPPFD。该纳米共递药系统具有不同的pH响应性,可以通过抑制癌相关成纤维细胞CAFs的增殖,而显著增强抗癌药物VCR对肿瘤细胞A549的毒性作用。